前處理方法及凍融次數對尿液蛋白標志物質量影響的探究

李啟沅，何旭珩，王 縣，劉小盼，孫建波，廖秋燕，尹潔芳，賈 佳，唐中湘，李 雪

·生物標志物·

前處理方法及凍融次數對尿液蛋白標志物質量影響的探究

李啟沅，何旭珩，王 縣，劉小盼，孫建波，廖秋燕，尹潔芳，賈 佳，唐中湘，李 雪

目的探究不同前處理方法及凍融次數對尿液樣本蛋白質量的影響。方法 取樣后的尿液樣本經過離心與不離心處理后，分別于室溫及4℃冷藏放置4、12、24、48、72 h，及在－80℃反復凍融1、3、5、10次后，經過橋式酶聯免疫吸附測定方法檢測叢生蛋白、腎損傷分子-1、胱抑素C及視黃醇結合蛋白4種蛋白的質量濃度變化。結果 經離心處理的樣本，在室溫或4℃冷藏放置48 h后，叢生蛋白質量濃度顯著降低。未經離心處理的樣本，室溫放置24 h后，叢生蛋白質量濃度顯著降低；4℃冷藏條件下蛋白相對穩定，在放置72 h后顯著降低。4種蛋白－80℃反復凍融1、3、5、10次后，質量濃度均無顯著變化；未經離心處理樣本，蛋白質量濃度較離心處理樣本高。結論 在冷凍保存前，盡量將尿液樣本先放置在4℃環境下處理或暫存，且暫存時間不超過72 h；若室溫放置，時間不超過24 h；且根據研究用途決定是否離心。樣本反復凍融10次對尿液蛋白質量無明顯影響，可以根據檢測需求及實際條件，確定樣本是否分裝及分裝管數等。

尿液蛋白標志物；尿液儲存；標志物質量

尿液是有重要意義的排泄物，其主要成分為尿素、無機鹽、微量蛋白質、代謝物等，其成分的變化反映代謝異常、泌尿系統或其他組織器官的病變，可作為無創、有效的疾病診斷生物材料。其中，尿液中某些蛋白的變化是包括腎損傷等疾病的重要標志，為疾病的診斷提供參考[1-5]。尿液也是生物樣本庫存儲重要的樣本之一，其采集、處理與保存的規范化操作是質量控制的重要保證；要獲得可靠的科學研究及應用成果，必須保證尿液樣本完整性[6-7]。

叢生蛋白，相對分子質量為80×103，它與清除細胞的碎片和凋亡的細胞相關。研究表明，叢生蛋白可作為膀胱癌診斷標志物[8]。腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)是一種跨膜蛋白，可作為早期腎損傷的診斷標志物[9-10]。胱抑素C是一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，廣泛存在于各種組織的有核細胞和體液中，由122個氨基酸殘基組成，相對分子質量為13.3×103，是一種低相對分子質量、堿性非糖化蛋白質，也是新近發展起來的評估腎功能的一種敏感性好、特異性高的指標[11-12]。視黃醇結合蛋白(retinol binding protein，RBP)是血液中維生素的轉運蛋白，由肝臟合成，廣泛分布于血液、腦脊液、尿液及其他體液中。測定RBP能早期發現腎小管功能損害，并能靈敏反映腎近曲小管的損害程度，還可作為腎功能早期損害和監護治療的指標[13-14]。

作者選用這4種常用作疾病診斷，且在健康人尿液中普遍存在的蛋白質作為研究對象，采用橋式酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA)方法，探討離心或者不離心情況下，前處理溫度、前處理放置時間及反復凍融對尿液樣本蛋白質量的影響，為優化樣本采集、規范尿液樣本前處理操作流程、保存條件及提高樣本保存質量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 收集來自健康成年人的晨尿樣本，男女各2人，項目經國家基因庫倫理委員會審批通過，捐贈者知情并簽訂知情同意書。96孔聚苯乙烯檢查板與KIM-1、胱抑素 C、叢生蛋白及 RBP、ELISA試劑盒均購自美國R＆D公司，其中試劑盒中配備有各種蛋白相應的標準品和牛血清白蛋白。磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)為美國Gibco公司產品。FLUOstar Omega全自動多功能酶標儀，購自德國BMG公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 捐贈者采集晨尿樣本50 mL于無菌的尿液采樣杯中。

1.2.2 樣本處理 尿液采集收集完畢后，即刻對樣本進行分裝處理。樣本處理流程參照圖1。所采集每份尿液50 mL充分混勻后，平均分成2部分，一部分經二步離心(1 600 r/min離心10 min后12 000 r/min再高速離心10 min)，以去除細胞及微粒等殘渣；另一部分不經離心，直接進行分裝。每部分樣本平均分裝成15管，每管1 mL，以進行尿液室溫前處理時間穩定性、4℃前處理時間穩定性及－80℃反復凍融次數研究測試。其中10管樣本分別在室溫及 4 ℃條件下放置 4、12、24、48、72 h；4 管放置于－80℃冰箱進行反復凍融測試，凍融次數分別為1、3、5、10次；另分別有 1管樣本，存放于－80℃作為項目對照樣本，即對照組(0 h)，在室溫處理檢測和凍融檢測中，分別與離心組、非離心組以及凍融檢測組樣本進行比較。1管PBS作為陰性對照。處理完的樣本檢測前暫存放于－80℃冰箱保存。

圖1 尿液樣本處理流程

1.2.3 ELISA 用PBS分別將KIM-1、胱抑素C、叢生蛋白及RBP捕獲抗體蛋白稀釋為一定比例，并包被在96孔板中，室溫下孵化過夜。400 μL清洗液清洗每孔3次，加1%牛血清白蛋白稀釋液300 μL，室溫下孵化1 h。加入100 μL處理后的尿液樣本、試劑盒配備的標準品或陰性對照品到相應孔位，室溫孵化2 h，洗板3次。KIM-1、胱抑素C、叢生蛋白及RBP相應板中分別添加100 μL檢測抗體，室溫孵化2 h，洗板3次；加入100 μL鏈霉親和素辣根過氧化物酶到每個孔；覆蓋后在室溫下避光孵化20 min，洗板3次。添加100 μL底物顯色液，室溫下避光孵化20 min；然后加入50 μL終止液，終止反應。在450 nm波長處檢測各孔的光密度值，根據不同質量濃度的標準品光密度值繪制標準曲線，并計算出測試尿液樣本的蛋白質量濃度。

1.3 統計學處理 采用GraphPad軟件，室溫前處理時間穩定性、4℃前處理時間穩定性及－80℃反復凍融測試樣本與對照組間差異采用t檢驗；如果數據為非正態分布，以中位數[四分位數間距(25%，75%)]表示，2組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同前處理方式對樣本質量影響 與對照組比較隨著時間的延長，經離心處理后的尿液樣本在室溫和4℃存放條件下，叢生蛋白質量濃度呈降低趨勢，且在48 h顯著降低(t室溫＝3.005、P室溫＝0.023 9，t4℃＝3.232，P4℃＝0.017 9)；而其他 3 種蛋白質量濃度無明顯變化。見圖2。未經離心處理的尿液樣本，室溫放置24 h后叢生蛋白質量濃度即出現顯著降低(t＝2.574，P＝0.049 8)，4 ℃放置 72 h后也顯著降低(圖3)；其他3種蛋白質量濃度無明顯變化。未經離心的尿液樣本叢生蛋白的起始質量濃度高于經離心處理的樣本。

圖2 經離心處理后的尿液叢生蛋白質量濃度

圖3 未經離心處理的尿液叢生蛋白質量濃度

2.2 凍融次數對樣本質量影響 相較離心處理樣本，未經離心處理的 KIM-1(t＝2.063、P＝0.085)和叢生蛋白(t＝1.920、P＝0.103)的初始質量濃度偏高，但差異無統計學意義(表1)。

尿液樣本在反復凍融1、3、5、10次后，4種蛋白質量濃度均無顯著變化(圖4)。

表1 不同凍融次數尿液4種蛋白質量濃度變化(pg/mL)

圖4 不同凍融次數尿液蛋白質量濃度

3 討論

本研究中選用叢生蛋白、KIM-1、胱抑素C、RBP 4種蛋白進行特異性檢測，研究不同處理方式對尿液樣本中蛋白質量的影響。結果顯示，隨著放置時間的延長，在室溫或4℃條件下放置的尿液樣本中，叢生蛋白質量濃度有下降趨勢；經離心處理的樣本，在室溫或4℃放置48 h后，叢生蛋白質量濃度顯著降低。未經離心處理的樣本，室溫放置24 h后，蛋白質量濃度便出現顯著降低；4℃條件下蛋白相對穩定，在放置72 h后顯著降低。對于離心/不離心處理的樣本，4℃相較于室溫，尿液蛋白更穩定，質量變化更小，更利于樣本質量的保存。與叢生蛋白相比，其他3種蛋白相對穩定，經過處理質量濃度無明顯變化。4種蛋白－80℃反復凍融1、3、5、10次后，質量濃度均無顯著變化，未經離心處理樣本蛋白質量濃度較離心處理樣本高。

總的來說，放置溫度、時間及是否經離心處理在一定程度上影響著尿液蛋白質量的變化。然而，目前缺乏比較通用有效的生物標志物實時檢測方法，尿液樣本無法立即進行分析處理；且對于檢測中心而言，并不是所有的檢測中心都建立了完善的檢測方法。因此，尿液樣本的暫存和運輸在實際情況中通常無法避免。本研究對尿液樣本檢測前的前處理條件進行了探索。

根據研究結果顯示，KIM-1、RBP、胱抑素C 3種蛋白標志物無論是否經過離心處理，在72 h以內處理對臨床結果無明顯影響。如果客觀檢測條件不能滿足，可暫且將尿液存放在4℃冷藏，72 h以內分析生物標志物即可。如果涉及尿液樣本的運輸，最好保證在室溫條件下不超過72 h。而叢生蛋白，穩定性相對較差，最好在室溫24 h以內就處理，如果存放在4℃則可適度延長至48 h以內處理。經過反復凍融10次，尿液中蛋白標志物均未受明顯影響，因此尿液樣本可先在－80℃儲存，在長期穩定性有效期內檢測即可。結合Adamo等[15]研究的長期穩定性結果，叢生蛋白在－80℃條件下可儲存3個月，而KIM-1和胱抑素C在－80℃條件下可儲存達12個月。因此，可根據檢測需求及實際條件，確定樣本是否分裝及分裝管數等，在長期穩定性有效期內對不同標志性蛋白進行檢測。

4種蛋白中，叢生蛋白在不同放置溫度、時間下，尿液蛋白質量濃度變化明顯，這一結果也與Adamo等[15]之前針對叢生蛋白的長期穩定性研究結果一致。這可能是由叢生蛋白的結構特點造成的。叢生蛋白較RBP和胱抑素C小分子蛋白相對分子質量偏大，且是由二硫鍵連接的異源二聚體蛋白，容易發生聚合形成二聚體、四聚體以及更高相對分子質量的寡聚物，從而對以ELISA法為基礎的質量濃度檢測造成影響[16]。叢生蛋白對存儲條件的變化敏感性高，因此該蛋白可作為尿液質控的標志性蛋白。

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Effects of pretreatment and freeze-thaw cycles on urinary biomarkers

LI Qiyuan， HE Xuheng， WANG Xian， LIU Xiaopan， SUN Jianbo， LIAO Qiuyan，YIN Jiefang， JIA Jia， TANG Zhongxiang， LI Xue
(China National GeneBank， BGI-Shenzhen， Shenzhen Guangdong 518083， China)

ObjectiveAimed to explore the effects of different pretreatment methods and freeze-thaw cycles on the quality of various urinary biomarkers.Methods Centrifuged or uncentrifuged urine samples were processed and stored at room temperature of 4℃ for 4，12，24，48 and 72 hours with freeze-thaw for 1， 3， 5， 10 cycles respectively.Then four urinary biomarkers including clusterin，kidney injury molecule 1(KIM-1)， cystatin C and retinol binding protein(RBP)were detected by enzyme-linked immune sorbent assay(ELISA).Results After stored at room temperature for 48 hours，the clusterin biomarker from centrifuged urine samples showed a significant reduction in concentration.While for the uncentrifuged urine samples，the cluster in biomarker showed a significant reduction in concentration after stored at room temperature for 24 hours or 4℃for 72 hours.After multiple freeze-thaw cycles， all 4 urinary biomarkers were stable， and the initial concentrations were higher for those urinary biomarkers from uncentrifugated urine samples.Conclusion Before detection or cryopreservation，urine samples were recommended to store at 4℃for maximum period of 72 hours，and stored at room temperature for no more than 24 hours.No significant degradation was detected for the four urinary biomarkers after freeze-thaw for 10 cycles，and the urine samples could be aliquoted and freezed based on research requirements.

Urinary biomarkers； Urine storage； Biomarker quality

Q592.2

A

2095-3097(2017)05-0257-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.05.001

深圳市科技計劃項目(JCYJ20160510141910129)

518083廣東 深圳，深圳華大基因研究院國家基因庫(李啟沅，何旭珩，王 縣，劉小盼，孫建波，廖秋燕，尹潔芳，賈 佳，唐中湘，李 雪)

[注 明]李啟沅，何旭珩:并列第一作者

2017-03-13 本文編輯:徐海琴)