血管生成素2與抗中性粒細胞胞漿抗體相關性血管炎活動的關系

張鳳霞+徐瑞權

[摘要] 目的 本研究旨在探討血管生成素2（angiopoietin-2，Ang2）與抗中性粒細胞胞漿抗體（anti-neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA）相關性血管炎（ANCA-associated vasculitis，AAV）活動的關系。 方法 本研究納入2012年5月～2016年5月間在我院住院的AAV患者共52例，所有AAV患者行伯明翰系統性血管炎活動評分（BVAS），選取BVAS<3分為非活動組，BVAS≥3分為活動組，選取我院同期健康體檢者20名作為健康對照組。收集AAV患者血清，檢測Ang2、血沉（ESR）、C反應蛋白（CRP）、循環內皮細胞（CECs）等，對Ang2 水平與血清學指標進行相關性分析。用特征性曲線（ROC）及曲線下面積（AUC）對Ang2、CRP 及 ESR 區分活動期及非活動期的準確度進行評價。 結果 活動組患者的血Ang2、ESR、CRP、CECs 及 BVAS 評分較非活動組患者明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。Ang2 水平與24 h 尿總蛋白（r=0.461，P<0.05）、BVAS（r=0.745，P<0.05）、CECs（r=0.657，P<0.05）分別呈正相關。ROC 分析顯示 Ang2 的曲線下面積明顯高于CRP和ESR，用外周血 Ang2 的濃度來區分 AAV 患者的非活動組與活動組準確度明顯高于 ESR 和 CRP（P<0.05）。 結論 Ang2 不僅可以作為ANCA相關性血管炎活動性的指標，還有望成為一些內皮細胞疾病的靶向治療藥物。

[關鍵詞] 血管生成素2；抗中性粒細胞胞漿抗體相關性血管炎；活動性；循環內皮細胞

[中圖分類號] R446.11 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）25-0015-04

The relationship between angiopoietin-2 and anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis activity

ZHANG Fengxia1 XU Ruiquan2

1.Department of Nephrology，the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Ganzhou 341000，China；2.Department of Urology，the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Ganzhou 341000， China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between angiopoietin-2（Ang2） and anti-neutrophil cytoplasmic antibodies（ANCA） ANCA-associated vasculitis（AAV） activity. Methods A total of 52 AAV patients who were hospitalized in our hospital from May 2012 to May 2016 were enrolled in the study. All AAV patients were given Birmingham systemic vasculitis activity score（BVAS）. The patients with BVAS<3 were divided into the non-active group， and the patients with BVAS≥3 were divided into the active group. 20 healthy volunteers who received physical examination in our hospital were selected as the healthy control group. The serum of AAV patients was collected， and Ang2， ESR， C-reactive protein（CRP）， circulating endothelial cells（CECs） were detected. Correlation analysis was carried out on Ang2 level and serological parameters. The accuracy of Ang2， CRP and ESR in differentiating the active and non-active phases was evaluated by the ROC and AUC. Results The levels of Ang2， ESR， CRP， CECs and BVAS scores in the active group were significantly higher than those in the non-active group， and the differences were statistically significant（P<0.05）. Ang2 level was correlated with 24 h urinary total protein（r=0.461， P<0.05）， BVAS（r=0.745，P<0.05） and CECs（r=0.657，P<0.05）. ROC analysis showed that the AUC of Ang2 was significantly higher than CRP and ESR. The accuracy of the concentration of Ang2 in peripheral blood in differentiating the active and non-active group was significantly higher than that in ESR and CRP in AAV patients（P<0.05）. Conclusion Ang2 can not only serve as an indicator of the activity of ANCA-associated vasculitis， but also is expected to be the drug of targeted therapy for some endothelial cell diseases.endprint

[Key words] Angiopoietin-2（Ang2）； ANCA-associated vasculitis（AAV）； Activity； Circulating endothelial cells（CECs）

抗中性粒細胞胞漿抗體（anti-neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA）相關性系統性血管炎（ANCA-associated vasculitis，AAV）是一組累及中、小血管的抗中性粒細胞胞漿抗體陽性的自身免疫性疾病。ANCA相關性血管炎近年發病率逐年攀升，且迄今缺乏早期診斷及特效治療的方法[1]。因此，探尋早期診斷指標具有重要意義。血管生成素2（angiopoietin-2，Ang2）是人體重要的血管特異性酪氨酸激酶感受器，對血管的穩定起著重要的作用。研究表明 Ang2 可促進血管內皮細胞的凋亡[2]。本文對 Ang2 與 ANCA 相關性血管炎活動的相關性進行分析，旨在探討Ang2在ANCA 相關性血管炎活動性評價中的意義。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年5月～2016年5月間在我院腎內科住院的AAV患者共52例。納入標準：（1）確診為AAV，診斷標準參照1994年美國Chapel Hill會議關于系統血管炎命名分類法及美國風濕病學會的分類標準[3]。（2）合并慢性腎臟病：①腎損害病程超過3個月，表現為不同程度的蛋白尿、血尿，無論有無腎功能的下降；②腎小球濾過率（GFR）<60 mL/（min·1.73 m2）持續超過3個月，無論有無腎損害表現。（3）血清ANCA陽性。排除標準：合并嚴重感染；合并惡性腫瘤疾病；其他自身免疫性疾病（包括系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎、硬皮病、皮肌炎、混合性結締組織病等）。其中男34例，女18例，平均年齡（61.10±13.75）歲。采用伯明翰系統性血管炎活動評分（BVAS）計算活動性評分，非活動組21例（BVAS評分<3分），活動組31例（BVAS評分≥3分）。另選取我院健康體檢者20例為對照組，其中男10例，女10例，平均年齡（60.50±12.79）歲，無相關免疫性疾病。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 在治療之前，清晨空腹采集外周血，注入含枸櫞酸鈉的抗凝管中，混勻后用離心半徑為10 cm 的離心機2000 r/min 離心10 min，分離血清，取上清分裝Eppendorf 管，置入-80℃冰箱冷藏。

1.2.2 相關指標的測定 采用全自動生化分析儀測定ESR、CRP、血肌酐、血分析、C3水平，收集并測量24 h 尿蛋白定量（均由贛南醫學院第一附屬醫院檢驗科進行操作完成）。

1.2.3 Ang2的測定 運用ELISA檢測血清中的Ang2，ELISA kit由R&D公司提供，操作按說明書。

1.2.4 CECs的測定 采用免疫磁珠分離方法檢測[4]。具體方法：抽取外周血2 mL，用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝。洗滌M-450 磁珠（Dynal，Hamburg，Germany），將稀釋后的抗CD-146 單抗（Biocytex，Marseilles，France）包被在磁珠表面，4℃孵育30 min，PBS洗滌后，用小牛血清封閉10 min，再次經PBS洗滌后，加入1 mL EDTA抗凝全血，混勻后，4℃孵育30 min，PBS洗滌后，用100 μL PBS懸浮磁珠，最后在顯微鏡下用細胞計數板計數，單位為（個/mL）。內皮細胞的鑒定標準：（1）細胞形態：較大體積的圓形或橢圓型細胞（直徑10～50 μm）；（2）必須和4個以上磁珠結合。

1.2.5 對所有樣本予BVAS 評價ANCA相關性血管炎活動性最常用的方法是伯明翰血管炎活動性評分（BVAS 1994）量表法[5]，通過一般情況、皮膚黏膜、耳鼻喉、胸部、心血管、腹部、腎臟、神經系統9大系統71項條目評價血管炎的活動性。選取BVAS<3分為非活動組，BVAS≥3分為活動組。

1.3 統計學方法

采用SPSS19.0軟件進行統計學分析，計數資料采用χ2檢驗，計量資料用均數±標準差表示，三組間比較用方差分析，分別將Ang2水平與BVAS相關性分析用 Pearson 相關性分析。用特征性曲線（ROC）及曲線下面積（AUC）對Ang2、CRP及ESR區分活動期及非活動期的準確度進行評價。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組臨床資料比較

活動組患者血Ang2、血沉、C反應蛋白、CECs、血沉及BVAS明顯較非活動組患者明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05），其余各項基本臨床特征方面比較無顯著性差異（P>0.05）。見表1。

2.2 AAV患者Ang2與各項臨床檢驗項目的相關性分析

Ang2 水平與24 h 尿總蛋白（r=0.461，P<0.05）、BVAS（r=0.745，P<0.05）、CECs（r=0.657，P<0.05）分別呈正相關。見圖1。

2.3 AAV患者在非活動組和活動組Ang2、CRP、ESR的ROC曲線分析

Ang2區分非活動組與活動組AAV患者的曲線下面積為0.976，P<0.001，95%置信區間（0.943～1.000）；ESR區分非活動組與活動組AAV患者曲線下面積為0.698，P=0.016，95%置信區間（0.555～0.841）；CRP區分非活動組與活動組AAV患者曲線下面積為0.769，P=0.001，95%置信區間（0.628～0.910）。Ang2作ROC曲線，得出約登指數最大值為0.873，即以Ang2=574 ng/L時，其靈敏度和特異度分別為96.8%和90.5%。Ang2的曲線下面積明顯高于CRP和ESR（P<0.01），提示用外周血Ang2的濃度來區分AAV患者的非活動組與活動組準確度明顯高于ESR和CRP。見封三圖2。endprint

3 討論

ANCA介導的中性粒細胞與內皮細胞的損傷是ANCA相關性血管炎的重要發病機制[6]。ANCA激活中性粒細胞導致血管壁的粘連、滲透脆性改變及血管內皮的損壞[7]。被損害的內皮細胞失去與周圍細胞或細胞外基質的連接，使內皮細胞與基底膜分離并釋放至外周血中[8]，外周血中的循環內皮細胞（CECs）數量增加。因此，我們可以通過計算外周血中的循環內皮細胞來衡量血管的損害[9]，并可作為評價疾病活動的量化指標。目前，評價ANCA相關性血管炎活動性最常用的方法是伯明翰血管炎活動性評分（BVAS 1994）量表法[5]。另外，臨床上血沉（ESR）、C反應蛋白（CRP）也是較為常用的血管炎性活動性評價指標[10]。但上述方法均有一定的局限性，尤其不能在疾病的早期準確地評價其活動度及臨床療效。

本研究檢測了AAV患者外周血中活動組患者血Ang2、ESR、CRP及BVAS明顯較非活動組患者明顯升高，標志著Ang2與ESR、CRP、BVAS一樣，可用來區別AAV患者是否活動。24 h 尿總蛋白不僅是多種全身性疾病早期腎損害的敏感指標，而且是病情演變和療效判斷的重要指標。本研究通過相關性分析發現AAV患者血清Ang2水平與24 h尿總蛋白呈正相關，且 Ang2 水平與 BVAS、CECs 也分別呈正相關。用外周血 Ang2 的濃度來區分 AAV 患者的活動組和非活動組準確度明顯高于 ESR 和 CRP，Ang2 作為臨床評價ANCA 相關性血管炎活動性指標具有明顯優勢。

Woywodt A等[11]在2003年研究報道了ANCA相關性血管炎患者外周血循環內皮細胞的數量，發現循環內皮細胞數目與疾病的活動性相關，在疾病活動期循環內皮細胞的數量明顯增多，而靜止期患者循環內皮細胞的數量減少，與本研究的結論一致。本研究顯示，Ang2與CECs數有明顯的相關性。本文不能說Ang2的濃度可直接影響到CECs數目，但大量臨床實驗己經證實Ang2與Tie2受體結合可以使內皮細胞失去屏障功能，導致內皮細胞分離[12]。因此，循環Ang2與CECs有相同的價值，本文猜測循環Ang2能夠減少內皮細胞的固著，導致內皮細胞分離致外周血中。Ang2的檢測比CECs更方便，因此，Ang2是評估內皮細胞活動的一個既方便又準確的方法[13]。

研究表明[14]，Ang2影響內皮細胞的穩定，使內皮細胞接受外源性刺激從而促進炎癥因子（腫瘤壞死因子和白細胞介素-1）和血管因子（血管內皮生長因子）活動。Ang2儲存在WP小體（Weibel-Palade）中，在受到刺激后快速釋放，與Ang-Tie2結合，從而促進血管的炎癥反應及內皮細胞的分離。Ang2在靜止的內皮細胞中表達很弱，而在活動的內皮細胞中表達很強[2]。

到目前為止，在很多實驗中己經被證實Ang2可以用于某些疾病的治療[15]。Ang2在評估AAV患者的準確度上高于傳統標志物CRP及ESR。Ang2 不僅可能作為一種新的監測 ANCA相關性血管炎活動性的指標，還有望成為一些患者內皮細胞疾病的靶向治療藥物。

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