大蒜素與化療藥物對食管癌細胞EC109療效比較的實驗研究*

曹成章， 胡樹橋， 賴海銀， 陳夢君， 石瑜珍， 吳 健△

(福建醫科大學附屬龍巖第一醫院 1心胸外科， 2重癥醫學科， 福建 龍巖 364000)

大蒜素與化療藥物對食管癌細胞EC109療效比較的實驗研究*

曹成章1， 胡樹橋1， 賴海銀1， 陳夢君1， 石瑜珍2， 吳 健1△

(福建醫科大學附屬龍巖第一醫院1心胸外科，2重癥醫學科， 福建 龍巖 364000)

目的通過與化療藥物比較的實驗研究探討大蒜素對食管癌的抗腫瘤效果及其可能機制。方法不同濃度的大蒜素、5-氟尿嘧啶和順鉑作用于食管癌細胞EC109，分別在6 h、12 h、24 h、48 h和72 h應用CCK-8法檢測EC109細胞的生長抑制率，并以分析細胞乳酸脫氫酶(LDH)活性反映各藥物的細胞毒性；Annexin V/PI雙染法檢測空白對照組、Z-VAD-FMK(caspase-3活性抑制劑)組、大蒜素組、大蒜素+Z-VAD-FMK組、5-氟尿嘧啶組和順鉑組的細胞凋亡情況。分光光度測定法檢測細胞內caspase-3、8、9的活性變化。結果大蒜素呈濃度依賴性及時間依賴性抑制和殺傷食管癌細胞EC109；與5-氟尿嘧啶組和順鉑組比較，大蒜素組LDH活性明顯下降；與對照組相比，大蒜素培養細胞內caspase-3、8的活性增強，而細胞內caspase-9的活性變化差異無統計學顯著性。結論大蒜素可能通過活化caspase-8激活外源性凋亡通路，誘導食管癌細胞EC109凋亡，從而抑制腫瘤細胞的生長，且與5-氟尿嘧啶和順鉑相比，大蒜素的細胞毒副作用明顯減弱。

大蒜素； 5-氟尿嘧啶； 順鉑； 食管癌； 細胞凋亡

食管癌是世界最常見的惡性腫瘤之一。最近報道，在我國食管癌的粗死亡率為17.19/10萬，占全部腫瘤死因的第4位，比例為15.21%[1]。食管癌仍然嚴重威脅我國居民生命健康。鑒于目前醫療衛生現狀，食管癌患者就診時多數已發展至晚期[2-3]，手術和放化療對患者身心有強烈的副作用。開發具有抗癌作用且副作用輕的天然藥物，從傳統中藥和天然植物中尋找和提取防治腫瘤的有效成分己成為治療腫瘤的希望和新途徑。

大蒜素(allicin)是從百合科蔥屬植物大蒜的鱗莖(大蒜頭)中提取的一種有機硫化合物，化學名為二烯丙基硫代亞磺酸酯，其抗菌、消炎、提高機體免疫力和抗腫瘤的作用逐漸引起各專家學者的廣泛關注[4-5]。近年來，隨著對大蒜素的化學作用、藥理作用及臨床應用的深入研究，國內外學者發現大蒜素能抑制食管癌細胞的細胞活力[6-7]，但其抗食管癌的效果及其機制仍然不明確。本研究擬比較大蒜素與傳統化療藥物對食管癌細胞EC109的療效，為大蒜素的抗腫瘤臨床應用提供更加豐富可靠的實驗依據。

材 料 和 方 法

1細胞及細胞培養

人食管癌細胞株EC109購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心。使用含有10%胎牛血清的1640培養液，置于37 ℃、5% CO2且飽和濕度的細胞培養箱中培養。2 d換液1次，2～3 d傳代1次，取處于對數生長期的細胞用于實驗。

2主要試劑和儀器

大蒜素購自中國北京世紀奧科生物技術有限公司；CCK-8試劑盒、順鉑(cisplatin)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)、caspase-3活性抑制劑Z-VAD-FMK、Triton X-100和HEPES購自Sigma；1640培養液購自HyClone；胎牛血清(購自Gibco)；Annexin V/碘化丙啶(propidium iodide，PI)凋亡檢測試劑盒(購自BD)。Ac-DEVD-AFC購自BIOMOL；乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒購自Roche。SpectraMax M2/M2e酶標儀為Molecular Devices Corp產品；Enspire熒光酶標儀為PerkinElmer產品。

3實驗方法

3.1CCK-8法檢測EC109細胞生長抑制率 將EC109細胞以每孔5×103個接種于96孔培養板，待生長24 h至單層融合后，加用0、20、40、60、80、100、120、140、160和180 mg/L大蒜素處理細胞6 h、12 h、24 h、48 h和72 h。更換新鮮的培養基后，每孔加入CCK-8試劑10 μL，繼續培養2 h；用酶標儀測定450 nm波長各孔吸光度(A)值。細胞存活率=處理組細胞A值/正常對照組細胞A×100%。

3.2LDH活性的測定 如上述處理細胞，吸取上清液，參照Korzeniewski等[8]的方法，根據LDH試劑盒說明書要求用分光光度儀測定各孔A值，計算LDH活性。

3.3Annexin V/PI雙染法流式細胞術檢測細胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化EC109細胞，微量離心機2 000 r/min離心5 min，棄培養基；用預冷PBS 洗滌細胞2次，4 ℃、3 000 r/min 離心5 min，收集細胞；300 μL 1×binding buffer 懸浮細胞，濃度大約為1×109cells/L；細胞懸浮液中加入 5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻后于4 ℃避光條件下孵育15 min；加入5 μL PI 后輕輕混勻于4 ℃避光條件下孵育5 min；1 h內用流式細胞儀檢測。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，表現為FITC-/PI-；右下象限為早期凋亡細胞，表現為FITC+/PI-；右上象限為中晚期凋亡細胞和壞死細胞，顯現FITC+/PI+。同時設空白對照組。

3.4Caspases活性的檢測 Caspase-3、8、9活性按照本實驗室建立方法測定，具體步驟如下：(1)取6孔酶標板(細胞數約1×106個)加入10 μL裂解液，制備細胞裂解液；(2)考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度；(3)caspases活性檢測：取96孔酶標板，向各孔中加入50 μL的2×reaction buffer、30 μL樣品、10 μL的蒸餾水、10 μL的AC-DEVD-AFC(caspase-3底物)或AC-IETD-AFC(caspase-8底物)或AC-IEHD-AFC(caspase-9底物)振蕩混勻，分別于0 min和37 ℃孵育90 min后，利用Enspire熒光酶標儀檢測熒光度值(Ex: 400 nm； Em： 508 nm)；(4)caspase-3、8、9活性計算：校正熒光度值=(90 min的熒光度值-0 min的熒光度值)÷蛋白濃度，以對照組的活性為1，其余各組caspases相對活性=實驗組校正熒光度值/對照組校正熒光度值。

4統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行統計分析。實驗結果均以均數±標準差(mean±SD)表示，兩組均數的比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1大蒜素具有抑制和殺傷食管癌細胞EC109的作用

CCK-8法檢測EC109細胞生長抑制率,結果顯示大蒜素能明顯抑制食管癌EC109細胞的生長(P<0.05)，表明大蒜素對EC109細胞的生長抑制作用呈時間和劑量依賴性，但當濃度增大到一定濃度(大于120 mg/L)時，其對細胞的抑制率增強不明顯，見圖1A。同時，我們參照Korzeniewski等[8]的方法測定不同濃度的大蒜素作用6 h、12 h、24 h、48 h和72 h后EC109細胞培養基中的LDH活性，結果表明大蒜素對細胞LDH的釋放具有濃度依賴性及時間依賴性，然而當大蒜素濃度大于100 mg/L時，在孵育48 h后LDH漏出率明顯增加(P<0.01)，見圖1B。

Figure 1. The EC109 cells were treated with different concentrations of allicin (0, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160 and 180 mg/L)， and then the cell viability (A) and activity of LDH (B) were detected at 6 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L group.

圖1大蒜素在不同濃度和作用時間不同的條件下對食管癌細胞EC109活性及LDH釋放的影響

2氟尿嘧啶具有抑制和殺傷食管癌細胞EC109的作用

CCK-8法檢測EC109細胞生長抑制率的結果顯示，5-氟尿嘧啶能明顯抑制食管癌EC109細胞的生長(P<0.05)，呈時間和劑量依賴性，其結果趨勢與既往文獻結果吻合；5-氟尿嘧啶作用于EC109細胞后，培養基中的LDH活性具有濃度依賴性及時間依賴性升高，見圖2。

3順鉑具有抑制和殺傷食管癌細胞EC109的作用

CCK-8法檢測EC109細胞生長抑制率的結果顯示，順鉑能明顯抑制食管癌EC109細胞的生長，在同一時點，不同濃度的順鉑對EC109細胞抑制率的差異有統計學顯著性；在同一濃度順鉑作用下，隨著時間的延長，順鉑對EC109細胞的生長抑制作用明顯增強，見圖3。這表明順鉑對食管癌細胞EC109細胞的生長抑制作用呈時間和劑量依賴性，其結果趨勢與既往文獻結果吻合。

Figure 2. The EC109 cells were treated with different concentrations of 5-fluorouracil (5-FU; 0, 20, 30, 40 and 50 mg/L), and then the cell viability (A) and activity of LDH (B) were detected at 6 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L group.

圖2不同濃度的5-氟尿嘧啶作用于食管癌細胞EC109不同時點的細胞活力百分比及LDH活性的變化

4凋亡抑制劑阻止大蒜素抑制食管癌EC109細胞，且大蒜素的細胞毒性作用明顯減弱

選擇空白對照組、Z-VAD-FMK組、大蒜素(100 mg/L)組、大蒜素+Z-VAD-FMK組、5-氟尿嘧啶(30 mg/L)組和順鉑(40 mg/L)組EC109細胞，經Anne-xin V/PI雙染檢測顯示大蒜素、5-氟尿嘧啶和順鉑均能明顯抑制EC109細胞的生長(P<0.01)?？瞻讓φ战M、Z-VAD-FMK組和大蒜素+Z-VAD-FMK組EC109細胞生長抑制率的差異無統計學顯著性。大蒜素組LDH活性明顯低于5-氟尿嘧啶和順鉑組(P<0.01)，表明大蒜素的細胞毒性作用明顯減弱，見圖4。

5大蒜素通過啟動caspase-8途徑誘導食管癌EC109細胞凋亡

為了進一步明確大蒜素誘導EC109細胞凋亡的途徑，我們通過大蒜素(100 mg/L)孵育EC109細胞48 h后，檢測細胞內caspase-3、8、9活性的變化。與對照組比較，實驗組細胞內caspase-3、8的活性與對照組相比明顯增高(P<0.05)，實驗組細胞內caspase-9的活性與對照組相比差異無統計學顯著性，見圖5。

討 論

目前我國食管癌的臨床治療主要以手術及放療化療為主要手段，副作用大，預后差，嚴重威脅人民的身體健康[1, 3]，不斷尋求新的有效藥物以提高療效、降低副作用是食管癌治療學發展的重要任務之一。眾所周知，大蒜素對于多種腫瘤都具有良好的抑制作用[9-10]，通過研究，我們發現大蒜素對EC109細胞的抑制率隨著藥物濃度的增加而增大，且藥物作用時間對細胞抑制率亦產生了較顯著的影響，藥物作用時間越長，對細胞的抑制率越高，同時與5-氟尿嘧啶和順鉑的比較發現，其殺傷細胞毒性明顯比化療藥物弱。

Figure 3. The EC109 cells were treated with different concentrations of cisplatin (0, 20, 30, 40 and 50 mg/L)， and then the cell viability (A) and LDH activity (B) were detected at 6 h， 12 h， 24 h， 48 h and 72 h. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L group.

圖3不同濃度的順鉑作用于食管癌EC109細胞在不同的時點細胞活力的變化及LDH活性的比較

大蒜素能抑制食管癌EC9706細胞的增殖能力，誘導細胞凋亡[7]，但是關于大蒜素抗腫瘤療效的研究仍然不夠深入。我們的實驗結果提示大蒜素對EC109細胞的生長抑制作用呈時間和劑量依賴性，值得注意的是100 mg/L大蒜素孵育EC109細胞48 h后細胞抑制作用明顯增強，與小于100 mg/L的各個濃度的生長抑制率之間的差異存在統計學顯著性；而大蒜素濃度大于120 mg/L孵育EC109細胞在48 h和72 h細胞的生長抑制率比較差異無統計學顯著性。大量的離體實驗研究表明，化療藥物殺傷腫瘤細胞可以反映化療藥物對機體的毒副作用[11-12]，然而大蒜素是否具有殺傷細胞的作用，目前仍不清楚。LDH是體內能量代謝過程中的一個重要的酶，正常情況下不能通過細胞膜。由于壞死的細胞胞膜破裂LDH釋放，分布于培養液中，此時測得培養液的LDH的活力可以代表培養細胞中壞死細胞的量[13]。我們參照Korzeniewski等[8]的方法檢測了對照組和實驗組培養液中的LDH的活性，結果提示大蒜素濃度小于80 mg/L時各個濃度的EC109細胞在各個時點LDH漏出率與對照組比較差異無統計學顯著性，而當大蒜素濃度大于100 mg/L時在孵育48 h后LDH漏出率與對照組比較具有統計學意義，提示大蒜素作用時間過長或者濃度增加到一定量時可能具有毒性作用。故在接下來的研究中，選擇大蒜素的實驗濃度劑量為100 mg/L，作用EC109的研究時間為48 h。

現在已經明確大多數抗腫瘤藥物都通過傳遞各種信號誘導腫瘤細胞凋亡，選擇性地誘導腫瘤細胞凋亡可能是治療惡性腫瘤的一個基本策略，也是評定化療藥物或化療方案是否有效的一個重要依據[14-15]。研究中我們將食管癌常用化療藥物順鉑和5-氟尿嘧啶孵育EC109細胞進行體外陽性對照實驗，通過CCK-8檢測細胞活力，觀察順鉑和5-氟尿嘧啶對細胞活力的影響，通過檢測培養液中LDH的活性，觀察順鉑和5-氟尿嘧啶對EC109細胞的殺傷破壞作用，結果提示5-氟尿嘧啶和順鉑具有抑制EC109細胞的作用，且具有濃度依賴性及時間依賴性，這與文獻報道一致[15-16]。然而我們發現當5-氟尿嘧啶濃度大于20 mg/L時在孵育48 h后LDH漏出率與對照組比較差異具有統計學意義，而順鉑濃度大于30 mg/L時在孵育48 h后LDH漏出率與對照組比較差異具有統計學意義，表明5-氟尿嘧啶和順鉑大于上述濃度作用48 h后 EC109細胞出現壞死，因此我們選擇20 mg/L 5-氟尿嘧啶、30 mg/L順鉑作為陽性對照組進行實驗。流式細胞術檢測發現大蒜素通過誘導細胞凋亡抑制EC109細胞的生長，其作用能被caspase廣譜抑制劑Z-VAD-FMK阻斷，且大蒜素作用細胞后其LDH漏出率明顯小于5-FU和順鉑，這一結果提示大蒜素具有抑制食管癌細胞生長，但其細胞毒性明顯比化療藥物弱。

Figure 4. The apoptosis， viability and LDH activity of EC109 cells. A: Flow cytometry with Annexin V-FITC and PI double staining was used to analyze the apoptosis of the EC109 cells； B: the cell viability was detected by CCK-8 assay at 48 h; C: the activity of LDH was analyzed at 48 h. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vsallicin group.

圖4食管癌EC109細胞凋亡、活力和LDH活性的變化

Figure 5. The EC109 cells were treated with 100 mg/L allicin for 48 h， and then the enzyme activity of caspase-3, caspase-8 and caspase-9 was measured by spectrophotometry. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖5100mg/Lallicin作用于食管癌EC109細胞48h后檢測caspase-3、caspase-8和caspase-9活性的變化.

細胞凋亡是一種由基因調控的、高度有序的、能量依賴和一系列酶參與的細胞主動死亡過程，具有復雜的分子生物學機制。當前抗腫瘤研究的一個重要方向是腫瘤細胞凋亡的誘導，根據發生過程中是否有caspase參與，細胞凋亡的發生分為caspase依賴性途徑和caspase非依賴性途徑，一般以前者為主[17]。目前已證實的caspases活化途徑主要有3條：一是由細胞表面受體受到刺激引起caspase-8和/或caspase-10活化(死亡受體途徑或外源性途徑)；二是應激刺激線粒體，線粒體釋放多種致凋亡因子引起caspase-9活化(線粒體途徑或內源性途徑)；三是經內質網途徑引起caspase-12活化并轉運到胞漿，在胞漿內激活caspase-9誘導凋亡。這3條途徑最終主要激活凋亡效應酶即caspase-3，而caspase-3的激活主要受到caspase-8和caspase-9的調節。為了研究大蒜素通過哪條途徑誘導食管癌細胞凋亡的方式抑制食管癌細胞生長，我們檢測了大蒜素對EC109細胞內caspase-3、8、9活性變化的影響。實驗結果提示實驗組細胞內caspase-3、8的活性與對照組相比明顯升高，實驗組細胞內caspase-9的活性與對照組相比差異無統計學顯著性，表明大蒜素能夠使外源性凋亡通路中caspase-8活化，激活外源性凋亡通路誘導細胞凋亡。

綜上所述，本研究結果提示大蒜素通過活化caspase-8、激活外源性凋亡通路而誘導食管癌細胞EC109凋亡，從而抑制腫瘤細胞的生長，具有濃度依賴性及時間依賴性，但大蒜素作用時間過長或者濃度增加到一定量時可能會引起毒副作用，并且與5-氟尿嘧啶和順鉑比較的實驗提示大蒜素毒副作用明顯較弱。結果表明大蒜素有較強的抗腫瘤活性，毒副作用小，具有廣闊的應用前景，但是關于大蒜素抗腫瘤作用機制的研究仍然不夠深入。因此，今后我們還應該進一步加強其作用機制的研究，為大蒜素臨床抗食管癌的應用提供更加充分的依據。這將為食管癌患者的臨床預防和治療提供一個新的思路和靶點。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

AntitumoreffectofallicinonesophagealcancerEC109cellscomparedwithchemotherapeuticsinvitro

CAO Cheng-zhang1, HU Shu-qiao1, LAI Hai-yin1, CHEN Meng-jun1, SHI Yu-zhen2, WU Jian1

(1DepartmentofCardiothoracicSurgery，2IntensiveCareUnit,LongyanFirstHospitalAffiliatedtoFujianMedicalUniversity,Longyan364000,China.E-mail: 921275589@qq.com)

AIM: To investigate the inhibitory effect of allicin on human esophageal cancer cell line EC109 and its possible mechanism by comparison with chemotherapeutic drugs.METHODSThe EC109 cells were treated with different concentrations of allicin, 5-fluorouracil and cisplatin. The cell viability was detected by CCK8 assay and the activity of lactic dehydrogenase (LDH) was analyzed at 6 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h. The apoptosis of the EC109 cells induced by Z-VAD-FMK, allicin, allicin+Z-VAD-FMK, 5-fluorouracil and cisplatin was analyzed by flow cytometry with Annexin V-FITC and PI double staining. The enzyme activity changes of caspase-3, caspase-8 and caspase-9 were detected by spectrophotometry.RESULTSAllicin had inhibitory effect on the growth of the EC109 cells and killed them in concentration-dependent and time-dependent manners. LDH activity was decreased compared with 5-fluorouracil and cisplatin. The increased activity of caspase-3 and caspase-8 in allicin-treated cells was statistically significant, but caspase-9 activity changed without statistical significance.CONCLUSIONAllicin inhibits the growth of EC109 cells in concentration- and time-dependent manners through extrinsic apoptosis pathways activated by caspase-8, and the side effects are weaker compared with 5-fluorouracil and cisplatin.

Allicin; 5-Fluorouracil; Cisplatin; Esophageal cancer; Apoptosis

R730.23； R965

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.018

1000- 4718(2017)10- 1845- 07

2017- 02- 10

2017- 05- 24

福建省衛生廳青年科研基金資助項目(No. 2013-2-150);福建醫科大學非直屬附屬醫院科學研究專項基金資助項目(No. FZS13013Y)

△通訊作者 Tel: 0597-2236984; E-mail: 921275589@qq.com

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