王金丹， 喬莞寧， 朱 靜， 付瑤陽， 胡萬里， 董人杰， 洪凱睿， 張佳麗， 王方巖△

(溫州醫科大學 1檢驗醫學院、生命科學學院， 2基礎醫學院病理生理學教研室， 浙江 溫州 325035)

酪酸梭菌代謝產物丁酸和氫氣對急性胃黏膜損傷的作用*

王金丹1， 喬莞寧2▲， 朱 靜2， 付瑤陽2， 胡萬里1， 董人杰2， 洪凱睿2， 張佳麗2， 王方巖2△

(溫州醫科大學1檢驗醫學院、生命科學學院，2基礎醫學院病理生理學教研室， 浙江 溫州 325035)

目的前期研究表明酪酸梭菌對損傷的胃黏膜具有保護作用，但具體效應物質不明。本文通過檢測酪酸梭菌的主要代謝產物氫氣和丁酸對損傷胃黏膜的效應，探究黏膜保護作用的具體機制。方法將雄性ICR小鼠通過乙醇灌胃誘導胃黏膜損傷，并以氫氣和丁酸分別進行處理，觀測胃組織的大體變化和組織結構損傷情況，通過RT-qPCR檢測炎癥因子白細胞介素12(IL-12)、Ras相關核蛋白1(RAN1)和單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)的含量，采用免疫組化法觀測Bcl-2和Bax蛋白表達量變化。結果胃組織大體觀測發現丁酸能夠保護胃黏膜，而氫氣不具有此作用；HE染色也提示丁酸能夠顯著改善乙醇造成的胃黏膜病理損傷。RT-qPCR則顯示所檢測炎癥因子IL-12、RAN1和MCP-1的表達量較模型對照組有顯著降低(P<0.01)。在丁酸組，Bax的表達量較模型組顯著減低(P<0.01)，而Bcl-2的含量卻明顯提高(P<0.01)。結論酪酸梭菌胃黏膜保護效應的主要產物可能是丁酸而不是氫氣。丁酸能夠通過抑制炎癥反應，下調Bax/Bcl-2表達比例，從而實現對胃黏膜的保護作用。

丁酸； 氫氣； 急性胃黏膜損傷； 炎癥； 細胞凋亡

胃黏膜損傷是臨床上常見的消化系統疾病。幽門螺旋桿菌感染，使用非甾體抗炎藥物以及過量飲酒是其最為主要的致病原因。胃黏膜損傷不僅降低了患者的生活質量并且容易癌變。現有的治療手段雖能夠取得較好的短期療效[1]，但長期來看，卻存在復發率高的嚴重不足。

本課題組之前的研究顯示酪酸梭菌對由阿司匹林[2]、應激、幽門結扎以及乙醇[3-4]誘導的小鼠胃黏膜損傷均具有顯著的保護效果，本文則在以往研究基礎上進一步研究其具體作用機制。酪酸梭菌能夠產生多種代謝產物，但其中最為主要是丁酸和氫氣。現有研究已證明丁酸和氫氣對炎癥及氧化相關的疾病均具有較為突出的治療或者預防效果。為了證實丁酸和氫氣是否為酪酸梭菌胃黏膜保護作用的具體效應物質，我們利用乙醇誘導的小鼠急性胃黏膜損傷模型，通過丁酸和氫氣分別進行干預，對胃組織的大體損傷和病理變化進行分析，判斷其作用，并檢測炎癥因子及凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達水平，對內在的具體機制進行探索。

材 料 和 方 法

1實驗動物

健康雄性ICR小鼠，體重25～30 g，由溫州醫科大學動物實驗中心提供，合格證號為SCXK(浙)2010-0150。

2實驗方法

2.1動物分組 將小鼠40只隨機分成4組，每組10只，分別為正常對照組、模型組、丁酸組和氫氣組。

2.2給藥情況及動物模型制備 丁酸組小鼠在造模前30 min以2 g/kg丁酸鈉的劑量進行灌胃；氫氣組小鼠在造模前30 min以0.6 mL的飽和氫水灌胃；模型組則灌予相同體積的生理鹽水。禁食24 h后，以劑量為10 mL/kg的無水乙醇灌胃，1 h后即建立起乙醇灼燒性胃損傷模型[5]。

2.3標本采集 在造模結束后，取胃組織，做大體觀察胃部黏膜面潰瘍狀況，一部分(n=4)用10%福爾馬林固定，用于HE染色，其余小鼠胃組織(n=6)凍存，用于后續指標測定。

2.4病理指標的檢測及方法 (1) 潰瘍面積：將胃組織展開平置后，進行掃描，獲得的圖像再用軟件Image-Pro Plus (IPP)6.0測量胃組織的總面積及出血潰瘍面積，并計算兩者的相對面積比例。(2)潰瘍抑制百分率：根據IPP軟件計算所得的潰瘍面積比值，依照以下公式進行潰瘍抑制率百分率計算：潰瘍抑制率百分率(%)=(對照組潰瘍面積比例-給藥組潰瘍面積比例)/對照組潰瘍面積比例×100%。(3)胃組織病理檢測：將10% 甲醛固定的各組胃組織標本，進行常規脫水石蠟包埋，然后制成病理切片，切片厚度約為4～5 μm，HE染色在光鏡下觀察胃黏膜的組織學變化。

2.5RT-qPCR 取50～100 mg小鼠胃組織于離心管中，加入1 mL TRIzol試劑后充分勻漿，常規操作提取總RNA。使用核酸蛋白分析檢測RNA濃度及純度。按照逆轉錄試劑盒(TIANGEN，貨號KT201)說明書合成樣品cDNA。以合成的cDNA為模板，按熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa，貨號RR820A)說明書，在25 μL體系內進行PCR擴增。引物序列如表1。反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s后采集熒光信號，重復40個循環。以GAPDH為內參照，用2-ΔΔCt計算出其相對表達量。

表1 引物序列

2.6免疫組化實驗 對Bcl-2和Bax進行免疫組化檢測， I 抗濃度通過預實驗確定。在常規抗體孵育清洗后，進行DAB復染。用IPP 6.0軟件進行圖像半定量分析，每張切片選取5個高倍鏡視野(×400)，測定各組小鼠胃黏膜Bax和Bcl-2陽性目標積分吸光度(A)值。

3統計學處理

采用SigmaPlot作圖分析，SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。實驗數據用均數±標準差(mean±SD)表示，多組數據的比較采用單因素方差分析，方差齊性則采用Bonferroni法，方差不齊者用Dunnett’s T3法，以P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1丁酸和氫氣對乙醇灼燒型胃潰瘍的胃黏膜大體形態的影響

為分析丁酸和氫氣的效果，我們觀察胃黏膜出血損傷程度，并通過IPP 6.0軟件計算潰瘍抑制率。乙醇造模后，小鼠胃黏膜呈現大面積的出血，并以沿血管分布為特征。有些胃壁有皺縮，出現條索狀變化，嚴重的出血位置甚至呈現黑色或暗紅色。丁酸明顯減輕了潰瘍出血損傷，潰瘍抑制率也顯著的提高，但是氫氣并未減輕胃黏膜的損傷，見圖1。

Figure 1. Macroscopic appearance of the gastric mucosa. A: normal group; B: model group; C: butyrate group; D: hydrogen group. Mean±SD.n=4.△△P<0.01vsnormal group;**P<0.01vsmodel group.

圖1各組小鼠胃黏膜掃描圖片

2丁酸對胃潰瘍病理變化的影響

從HE染色結果可以看出正常組的胃壁結構清晰完整，細胞形態正常；而模型組則出現了明顯的胃黏膜病理損傷，壞死的黏膜大量脫落，部分胃黏膜上皮出現缺損，腺體被破壞，腺腔內出現了脫落的上皮細胞碎片，還出現了炎細胞浸潤的現象；在使用丁酸后，胃黏膜損傷程度較模型組明顯縮小，黏膜上皮較完整連續，腺體的排列較整齊，未見明顯損傷，見圖2。

Figure 2. Histological assessment of acute gastric mucosal injury induced by ethanol (HE staining). A: normal group; B: model group; C: butyrate group.

圖2各組小鼠胃黏膜病理圖片

3丁酸對胃黏膜組織內炎癥因子的影響

對胃黏膜組織進行Rt-q RCR檢測炎癥因子表達水平。結果發現，與正常對照組比較，模型組的白細胞介素12(interleukin 12，IL-12)、Ras相關核蛋白1(Ras-related nuclear protein 1, RAN1)和單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)等多種炎癥細胞因子的相對表達量均有顯著提高。而丁酸處理組的各炎癥細胞因子與模型組相比，其相對表達量則均有顯著降低(P<0.01)，見圖3。

4丁酸對胃組織Bcl-2和Bax表達的影響

免疫組化結果顯示，正常組 Bax 表達為弱陽性，定位在胞漿，主要集中分布在黏膜層；模型組Bax的表達量為強陽性，積分吸光度明顯高于正常組，差異具有統計學意義(P<0.01)。而丁酸組Bax的表達量明顯低于模型組，其Bax的積分吸光度值顯著低于模型組，差異有統計學意義(P<0.01)。并且我們發現丁酸能夠顯著上調Bcl-2的表達(P<0.01),見圖4。

Figure 3. The relative mRNA expression of inflammatory factors in different groups. A: normal group; B: model group; C: butyrate group. Mean±SD.n=6.△△P<0.01vsnormal group;**P<0.01vsmodel group.

圖3各組小鼠胃組織IL-12、RAN1和MCP-1的mRNA相對表達量

Figure 4. The expression of Bax and Bcl-2 in different groups. A: normal group; B: model group; C: butyrate group. Mean±SD.n=4.△△P<0.01vsnormal group;**P<0.01vsmodel group.

圖4各組小鼠胃黏膜組織Bax和Bcl-2的表達情況

討 論

乙醇誘導的胃黏膜損傷，能夠復制較為典型的人類胃黏膜損傷的臨床表現，如胃黏膜的出血糜爛等，并且飲酒過多也是造成胃黏膜損傷的重要原因。因此，該模型常用于篩選胃黏膜保護作用物質。我們前期的工作已證實酪酸梭菌對胃黏膜的保護作用，本研究則進一步探索該菌的具體效應物質。酪酸梭菌是益生菌，能夠產生氫氣、丁酸、維生素B、乳酸等多種對人體有益物質，而其中產量最多生物效應最為突出的是氫氣[6]和丁酸[7]。本文對氫氣和丁酸的胃黏膜保護作用進行評價。

但我們發現氫氣組的胃組織損傷程度與模型組并無明顯差異，而丁酸組保護效應卻非常顯著。因此，判斷酪酸梭菌的主要效應產物可能不是氫氣而是丁酸。值得注意的是，有研究發現氫氣在大鼠應激型胃潰瘍中對胃黏膜有明顯的效應[8]，而且他們的給氫途徑是采用靜脈注射。我們認為結果的差異可能與給氫的劑量、途徑、所采用的動物種屬以及潰瘍模型不同等因素有關。關于氫氣對胃黏膜損傷的效應仍有待進一步深入研究。

丁酸對機體的影響可分為對腸內的作用和對腸外的作用。對腸內的作用包括：調節跨膜運輸、改善炎癥和氧化狀態的腸黏膜、增強黏膜屏障、調節內臟敏感性和蠕動，以及預防和抑制結腸癌[9]。腸外效果包括減輕血紅蛋白病[10-12]、高膽固醇血癥[13-14]、胰島素抵抗[15-16]及膿毒癥[17-18]等。而本研究中，我們發現丁酸能夠顯著減輕乙醇造成的胃黏膜損傷。

IL-12促進細胞介導的免疫應答能力，具有免疫刺激作用，可調節自然殺傷細胞的天然免疫和輔助型T細胞、細胞毒性T淋巴細胞介導的獲得性免疫應答[19-20]，是重要的細胞因子。眾多研究表明，IL-12與RAN1參與炎癥反應，可引起胃黏膜大量炎癥細胞浸潤及免疫反應，同時通過正反饋使炎癥反應不斷增強，干擾胃黏膜生理功能，造成局部損傷，引發后繼慢性炎癥與免疫相關疾病等。有研究證實，在急性胃黏膜損傷中，IL-12及RAN1表達顯著增加[21]，本實驗也證實了這一點。MCP-1屬趨化因子CC亞家族中一員，可由多種細胞分泌，募集單核細胞、嗜堿性粒細胞和T細胞至炎癥部位，經歷級聯反應，在炎癥過程中起促進作用[22]。已有大量相關研究表明，在相關急慢性胃炎及胃癌中，MCP-1表達水平也顯著提升[23]。在使用丁酸處理后，上述炎癥介子則有顯著下降，這提示丁酸具有抗炎作用，與其它研究的結論相一致[17]。以往研究已證實丁酸能夠抑制NF-κB，從而降低TNFα、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12等多種炎癥細胞因子表達，發揮抗炎作用[24]。丁酸作為組蛋白去乙酰化酶抑制劑，能夠調控基因的表達，也是其發揮抗炎作用的關鍵[25]。新近的研究認為丁酸可以通過其特異性受體GPR109a介導生物學效應[26]。丁酸在乙醇誘導的胃黏膜炎癥中通過何種機制發揮抗炎作用是我們下一步的需要探討的關鍵。

為評價丁酸對胃黏膜損傷的保護作用，我們測定了凋亡調控相關蛋白Bax和Bcl-2。這2個蛋白在凋亡過程中至關重要。當Bax表達量增加時，促進凋亡的發生，Bcl-2表達量增加時則具有抗凋亡作用。本研究發現，在乙醇模型組Bax的表達明顯上調，而Bcl-2的表達量基本不變。丁酸組Bax的表達量較模型組明顯減少，而Bcl-2的表達量顯著增加，這些數據提示丁酸可通過下調Bax的表達，上調Bcl-2的表達，抗凋亡實現對胃黏膜上皮的保護作用。但丁酸如何調控這2種蛋白，尚需深入研究。

總之，本文已證實丁酸是酪酸梭菌的胃黏膜保護效應的主要代謝產物，能夠減輕胃部炎癥反應，下調Bax/Bcl-2的表達比例，防止乙醇介導的胃黏膜的損傷，為更為深入的機制研究和臨床應用提供理論依據。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

EffectofmetabolitesofClostridiumbutyricum,butyricacidandhydrogen，onacutegastricmucosallesion

WANG Jin-dan1, QIAO Wan-ning2, ZHU Jing2, FU Yao-yang2, HU Wan-li1, DONG Ren-jie2, HONG Kai-rui2, ZHANG Jia-li2, WANG Fang-yan2

(1SchoolofMedicalLaboratoryScienceandLifeScience,2DepartmentofPathophysiology,SchoolofBasicMedicineScience,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China.E-mail:wzyxywfy@126.com)

AIM: To observe the antiulcer effect of butyric acid and hydrogen， the main metabolites ofClostridiumbutyricum(C.butyricum), and to explore the underlying mechanism.METHODSThe mouse model of acute gastric mucosal lesion was prepared by gavage with ethanol. The mice were randomly divided into 4 groups: normal group, model group, butyric acid group and hydrogen group. The mice in butyric acid group and hydrogen group were given butyrate and hydrogen prior to model establishment， respectively. Macroscopic observation of the pathological changes in gastric tissues was performed to evaluate the effect of the 2 metabolites ofC.butyricum. Meanwhile, the mRNA expression levels of inflammatory factors, such as IL-12, RAN1 and MCP-1, were determined by RT-qPCR. The expression levels of apoptosis-related proteins Bcl-2 and Bax were detected by immunohistochemical staining.RESULTSThe macroscopic observation found that butyrate, not hydrogen, protected gastric mucosa. HE staining also showed that butyrate significantly attenuated the pathological damage of the gastric mucosa induced by ethanol. Compared with model group, the mRNA levels of inflammatory factors IL-12, RAN1 and MCP-1 in butyrate group significantly decreased (P<0.01). In butyrate group, the protein level of Bax was obviously decreased compared with model group (P<0.01), while the protein level of Bcl-2 was significantly increased (P<0.01).CONCLUSIONThe gastric mucosa protective metabolite ofC.butyricummay be butyric acid, not hydrogen. Butyric acid protects the gastric mucosa against ethanol-induced lesion by inhibiting the inflammation and reducing the expression ratio of Bax/Bcl-2.

Butyric acid; Hydrogen; Acute gastric mucosal lesion; Inflammation; Apoptosis

R573.3； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.029

1000- 4718(2017)10- 1906- 06

2017- 04- 05

2017- 05- 31

浙江省科技廳項目(No. 2017C33068)；浙江省新苗人才計劃(No. 2017R413042)；溫州市科技局項目(No. y20150009)

△通訊作者 Tel: 0577-86689817; E-mail: wzyxywfy@126.com

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