SRSF9/SRp30c通過調(diào)控GRβ對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移的影響*

劉 艷， 邵阿末， 殷 瑩， 李 正， 張 銳， 宗 達(dá)， 鄒 健， 胡亞玲△

(1無錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校， 江蘇 無錫 214028； 2無錫人民醫(yī)院中心實驗室， 江蘇 無錫 214023)

SRSF9/SRp30c通過調(diào)控GRβ對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移的影響*

劉 艷1， 邵阿末1， 殷 瑩2， 李 正2， 張 銳2， 宗 達(dá)2， 鄒 健2， 胡亞玲2△

(1無錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校， 江蘇 無錫 214028；2無錫人民醫(yī)院中心實驗室， 江蘇 無錫 214023)

目的探討富含絲氨酸-精氨酸剪切因子9/富含絲氨酸-精氨酸蛋白30c(SRSF9/SRp30c)和糖皮質(zhì)激素受體β(GRβ)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)及兩者之間的關(guān)系。方法用小干擾RNA(siRNA)靶向干擾膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中SRSF9的表達(dá)，同時用慢病毒將短發(fā)卡RNA(shRNA)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，構(gòu)建SRSF9敲減的U87穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，通過熒光顯微鏡觀察并檢測轉(zhuǎn)染情況。通過RT-qPCR和Western blot法檢測SRSF9/SRp30c和GRβ的表達(dá)水平，CCK-8和細(xì)胞集落形成實驗檢測細(xì)胞的增殖能力，劃痕實驗檢測細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果用2種方法敲減SRSF9后，SRSF9/SRp30c表達(dá)均降低，GRβ的表達(dá)水平也隨之下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明，成功構(gòu)建了穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染效率超過80%。CCK-8實驗和細(xì)胞集落形成實驗的結(jié)果表明U87細(xì)胞在敲減SRSF9后，細(xì)胞活力和集落形成能力降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；劃痕實驗結(jié)果表明U87細(xì)胞在敲減SRSF9后，遷移能力明顯減弱,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論SRSF9/SRp30c可通過調(diào)控GRβ促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移。

膠質(zhì)瘤； 糖皮質(zhì)激素受體β； 富含絲氨酸-精氨酸剪切因子9/富含絲氨酸-精氨酸蛋白30c； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞遷移

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，具有高發(fā)病率、低生存率、浸潤生長、治療困難等特點，因而嚴(yán)重影響人類的健康，成為神經(jīng)外科領(lǐng)域的難點[1]。糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)屬于保守的核受體超家族中的成員，人GR基因由9個外顯子組成。富含絲氨酸-精氨酸剪切因子9(serine-arginine-rich splicing factor 9，SRSF9)/富含絲氨酸-精氨酸蛋白30c(serine-arginine-rich protein 30c，SRp30c)是真核生物中重要的剪接因子，可對GR第9個外顯子不同剪切產(chǎn)生2個主要亞型，即GRα和GRβ[2]。近年的研究表明GRβ是膠質(zhì)瘤的重要致病基因，在腫瘤相關(guān)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用[3-4]。同時也有文獻(xiàn)報道SRSF9/SRp30在人多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增加，與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切[5]。我們前期的數(shù)據(jù)分析顯示SRSF9/SRp30在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，但SRSF9/SRp30c在膠質(zhì)瘤中的功能及是否調(diào)控GRβ表達(dá)目前尚無文獻(xiàn)報道，因此本研究將對此進(jìn)行探討。

材 料 和 方 法

1材料

DMEM培養(yǎng)液和青霉素-鏈霉素混合液購自HyClone；LipofectamineTM2000和TRIzol購自Invitrogen；MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶及緩沖體系購自Promaga；dNTP和相關(guān)引物均由上海生工生物工程有限公司合成；PMSF、RIPA、SDS-PAGE凝膠配制相關(guān)產(chǎn)品和CCK-8細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；胎牛血清為Biological Industries生產(chǎn)；各種抗體購自Cell Signaling；PDTC為Sigma產(chǎn)品；PVDF膜、ECL化學(xué)發(fā)光底物來自Millipore。人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞株由中國科學(xué)院上海細(xì)胞所提供，以含10%胎牛血清的DEME培養(yǎng)液，5% CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代，傳代時間為每次2～3 d。實驗采用對數(shù)生長期細(xì)胞。

2儀器

HF160W型水套式二氧化碳培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；冷凍離心機(jī)(Eppendorf)； BioPhotometer Plus核酸蛋白測定儀(Eppendorf)；GeneAmp 9600型PCR擴(kuò)增儀(Perkin-Elmer)； LightCycler 2.0實時熒光定量PCR擴(kuò)增儀(Roche)；全波長Multiskan Spectrum酶標(biāo)儀(Thermo)；電泳設(shè)備(Bio-Rad)； IX71熒光倒置相差顯微鏡(Olympus)；FR-200A全自動紫外與可見光凝膠分析系統(tǒng)(上海普諾森生物科技有限公司)。

3主要方法

3.1小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)瞬時轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前將對數(shù)生長期的膠質(zhì)瘤細(xì)胞按3×105/孔接種到含無血清DMEM培養(yǎng)基的6孔板中，使轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度達(dá)到60%，根據(jù)操作說明轉(zhuǎn)染，分組為陰性對照(negative control)組和siRNA組，陰性對照組僅加轉(zhuǎn)染試劑，siRNA組加轉(zhuǎn)染試劑和siRNA的混合物。6 h后將各組培養(yǎng)基改為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)孵育，48 h和72 h后做后續(xù)實驗。

3.2短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期的U87細(xì)胞分為陰性對照(negative control)組和shRNA組，按1×105/孔接種于含無血清DMEM培養(yǎng)基的6孔板，待細(xì)胞貼壁后，以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)等于100作為腺病毒轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞的條件。陰性對照組轉(zhuǎn)染GV248空載體，shRNA組轉(zhuǎn)染GV248-SRSF9-shRNA，8 h后將各組培養(yǎng)基改為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)孵育，根據(jù)需要進(jìn)行后續(xù)檢測。

3.3轉(zhuǎn)染效率觀察和檢測 培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，24 h后通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況并采集照片，檢測轉(zhuǎn)染效率。

3.4RT-qPCR檢測 收集細(xì)胞，用TRIzol提取細(xì)胞總RNA。BioPhotometer Plus 核酸蛋白儀測定RNA濃度。取1 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。1 μL cDNA模板于25 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行RT-qPCR，其中GAPDH為內(nèi)參照， GAPDH的上游引物序列為5’-CCCATGTTCGTCATGGGTGT-3’，下游引物序列為5’-TGGTCATGAGTCCTTCCACGATA-3’；SRSF9的上游引物序列為5’-CCTGCGTAAACTGGATGACACC-3’，下游引物序列為5’-CCTGCTTTGGTATGGAGAGTCAC-3’；GRβ的上游引物序列為5’-GAAGGAAACTCCAGCCAGAA-CTG-3’，下游引物序列為5’-TGAGCGCCAAGATTGTTGG-3’。擴(kuò)增條件為95 ℃ 10 min; 94 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。以2-ΔΔCt相對定量法計算基因抑制效率。

3.5Western blot法檢測蛋白水平 收集各組細(xì)胞，用含1% PMSF的RIPA裂解細(xì)胞提取蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度。取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜。以5%脫脂奶粉封閉1 h，加入I抗4 ℃孵育過夜，TBST洗3遍，加入HRP標(biāo)記的 II 抗室溫孵育1 h，TBST洗4遍，采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。以β-actin為內(nèi)參照。

3.6CCK-8 法檢測細(xì)胞活力 按5×103/孔的密度將細(xì)胞接種于96孔板，加入不同濃度ADM孵育72 h。每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃繼續(xù)孵育2 h，多功能酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm波長下的吸光度(A450)。

3.7集落形成實驗 取細(xì)胞懸液計數(shù)，每組細(xì)胞分別以1×103/孔的密度接種于6孔板中，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的集落時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min。然后去除固定液，加適量結(jié)晶紫染色15 min，然后洗去染色液，空氣干燥，最后計算集落形成率。

3.8劃痕實驗 收集2組細(xì)胞，按第2天可長滿的量接種于6孔板中，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)板后劃痕，PBS洗去劃下的細(xì)胞，更換無血清培養(yǎng)基，于0和24 h分別采用顯微鏡觀察細(xì)胞的遷移情況，分別取4個視野拍照，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。細(xì)胞遷移能力以遷移率表示，細(xì)胞遷移率(%)=(原劃痕寬度-現(xiàn)劃痕寬度)/原劃痕寬度×100%。

4統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗， 以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1瞬時轉(zhuǎn)染SRSF9siRNA能抑制GRβ在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)

RT-qPCR實驗結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87轉(zhuǎn)染SRSF9 siRNA 48 h后，SRSF9 mRNA的表達(dá)水平較陰性對照組明顯下降(P<0.05)，同時siRNA組GRβ mRNA的表達(dá)水平較陰性對照組明顯下降(P<0.05)，見圖1。Western blot檢測結(jié)果顯示，siRNA組與陰性對照組比較，SRp30c和GRβ的蛋白表達(dá)量都顯著降低(P<0.05)，見圖2。這說明在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中敲減SRSF9可抑制GRβ的表達(dá)。

Figure 1. The mRNA expression of SRSF9 and GRβ in the U87 cells after transfected withSRSF9 siRNA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnegative control group.

圖1轉(zhuǎn)染SRSF9siRNA后U87細(xì)胞中SRSF9和GRβmRNA的表達(dá)情況

Figure 2. The protein expression of SRp30c and GRβ in the U87 cells after transfected withSRSF9 siRNA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnegative control group.

圖2轉(zhuǎn)染SRSF9siRNA后U87細(xì)胞中SRp30c和GRβ蛋白的表達(dá)情況

2敲減SRSF9后GRβ在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)降低

熒光顯微鏡結(jié)果表明成功構(gòu)建SRSF9敲減和陰性對照的U87穩(wěn)轉(zhuǎn)株，轉(zhuǎn)染效率超過80%，見圖3。RT-qPCR實驗結(jié)果顯示，在SRSF9敲減的U87細(xì)胞中，SRSF9 mRNA的表達(dá)水平較陰性對照組明顯下降(P<0.05)，同時GRβ mRNA的表達(dá)水平較陰性對照組明顯降低(P<0.05)，見圖4。Western blot檢測結(jié)果顯示，SRSF9 shRNA組與陰性對照組比較，SRp30c和GRβ的蛋白表達(dá)量都顯著降低(P<0.05)，見圖5。

3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SRSF9shRNA對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8實驗檢測結(jié)果表明，與對照組相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SRSF9 shRNA的實驗組細(xì)胞的活力明顯減弱(P<0.05)，見圖6。細(xì)胞集落形成實驗結(jié)果表明，與對照組相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SRSF9 shRNA的實驗組細(xì)胞集落形成能力明顯減弱(P<0.05),見圖7。

Figure 3. The transfection efficiency of the U87 cells 48 h after transfection (×100). Mean±SD.n=3.

圖3SRSF9敲減的U87細(xì)胞熒光轉(zhuǎn)染情況

Figure 4. The mRNA expression of SRSF9 and GRβ in the U87 cells after transfected withSRSF9 shRNA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnegative control group.

圖4SRSF9敲減后U87細(xì)胞中SRSF9和GRβ的mRNA表達(dá)

4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SRSF9shRNA對膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實驗結(jié)果結(jié)果表明與對照組相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SRSF9shRNA的實驗組細(xì)胞的遷移能力明顯降低,見圖8。

討 論

腦膠質(zhì)瘤是人顱內(nèi)最常見的原發(fā)惡性腫瘤，其主要特征是腫瘤細(xì)胞彌漫性浸潤生長、無明確邊界、無限增殖并具有高度侵襲性。膠質(zhì)瘤的手術(shù)、放化療等治療技術(shù)已取得長足的發(fā)展，但膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的5年生存率仍不足3%[6]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤在本質(zhì)上屬多基因病變，其發(fā)生發(fā)展受多種基因調(diào)節(jié)。因而，在基因調(diào)控水平上研究相關(guān)因子之間的關(guān)系是膠質(zhì)瘤的研究方向之一,尋求新的分子基因靶點成為治療膠質(zhì)瘤新的突破點。

Figure 5. The protein expression of SRp30c and GRβ in the U87 cells after transfected withSRSF9 shRNA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnegative control group.

圖5SRSF9敲減后U87細(xì)胞中SRp30c和GRβ蛋白水平的表達(dá)情況

Figure 6. The viability of U87 cells after transfected withSRSF9 shRNA detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnegative control group.

圖6SRSF9敲減后U87細(xì)胞活力的檢測結(jié)果

GR屬于核轉(zhuǎn)錄因子，廣泛分布于機(jī)體各組織細(xì)胞中。人GR基因由9個外顯子組成，第9個外顯子不同剪切結(jié)果產(chǎn)生GR兩個主要亞型，即GRα和GRβ。GRα在幾乎所有組織和細(xì)胞中表達(dá)，其含量遠(yuǎn)超GRβ。對GRβ的研究最近幾年才引起關(guān)注，發(fā)現(xiàn)GRβ對糖皮質(zhì)激素的生理及藥理作用起負(fù)性調(diào)控作用，尤其激素耐藥的腎病綜合征、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及血液腫瘤等疾病均認(rèn)為與GRβ的高表達(dá)有關(guān)[7-8]。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)GRβ在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)增加，是引起膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的一種致病因子[4]。

SRSF家族為富含絲氨酸精氨酸的剪接因子，是一類進(jìn)化十分保守的剪接因子家族，在mRNA生物合成的所有進(jìn)程中都發(fā)揮著重要作用[9]。SRSF家族的每個成員都可能有著其獨特的生物學(xué)功能。SRSF廣泛參與mRNA生物加工進(jìn)程，更參與調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)化、基因組穩(wěn)定性等多種重要生物學(xué)進(jìn)程[10]。有報道稱SRSF家族成員與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，SRSF1是一個原癌基因，它在許多腫瘤中表達(dá)上調(diào)，比如非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌中有高表達(dá)[11-13]。另一個家族成員SRSF3也在多種腫瘤中高表達(dá)，SRSF3也可以調(diào)控細(xì)胞周期和增殖相關(guān)蛋白的選擇型剪接，下調(diào)SRSF3會抑制細(xì)胞生長、阻滯G2/M和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生；過表達(dá)SRSF3同樣可促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生[14]。除此之外，SRSF9也是研究較多的一個成員，有報道稱其在膀胱癌中參與細(xì)胞增殖調(diào)控，上游是通過microRNA-1結(jié)合調(diào)控，但是SRSF9具體的下游作用機(jī)制仍不清楚[15]。另有研究表明SRSF9也是一個原癌基因，SRSF9不僅在許多腫瘤樣品中高表達(dá)，而且SRSF9過表達(dá)可以導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生，同時在結(jié)腸癌細(xì)胞系中下調(diào)SRSF9可以抑制軟瓊脂集落形成能力[5]。GRβ是SRSF9/SRp30c對GR外顯子進(jìn)行剪切之后形成的一種亞型結(jié)構(gòu)，在人網(wǎng)狀細(xì)胞中，用蛙皮素減少SRp30c的表達(dá)量，GRβ也降低，反之過表達(dá)SRp30c，GRβ隨之上升，故SRp30c可調(diào)節(jié)GRβ的表達(dá)量[16]。但SRSF9/SRp30c在膠質(zhì)瘤中的功能及是否調(diào)控GRβ表達(dá)目前尚無文獻(xiàn)報道。

Figure 7. Colony formation ability of the U87 cells after transfected withSRSF9 shRNA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnegative control group.

圖7SRSF9敲減后U87細(xì)胞集落形成的變化

Figure 8. The migration ability of the U87 cells after transfected withSRSF9 shRNA detected by wound healing experiment (×100). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnegative control group.

圖8細(xì)胞劃痕實驗檢測SRSF9敲減后U87細(xì)胞遷移能力的變化

本研究表明，靶向敲減SRSF9后，膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖和遷移能力都有減弱，此結(jié)果表明SRSF9/SRp30c也是促進(jìn)膠質(zhì)瘤增殖和遷移的因子；同時SRSF9被抑制后SRSF9/SRp30c的表達(dá)下降，GRβ在基因及蛋白水平表達(dá)也隨之下降，該結(jié)果提示SRSF9/SRp30c可通過調(diào)控GRβ促進(jìn)膠質(zhì)瘤增殖和遷移。故SRSF9/SRp30c可能通過調(diào)控GRβ影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的一些生物學(xué)功能，但SRSF9/SRp30c促進(jìn)GRβ表達(dá)是否與其選擇性剪切功能有關(guān)尚未明確，同時SRSF9/SRp30c有可能在膠質(zhì)瘤中還參與其它與腫瘤相關(guān)的基因的選擇性剪切，也需進(jìn)一步的探討。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

EffectsofSRSF9/SRp30conproliferationandmigrationabilitiesofgliomacellsbyregulatingGRβ

LIU Yan1, SHAO A-mo1, YIN Ying2, LI Zheng2, ZHANG Rui2, ZONG Da2, ZOU Jian2, HU Ya-ling2

(1WuxiHigherHealthVocationalTechnologySchool,Wuxi214028,China;2CentralLaboratoryofWuxiPeople’sHospital,Wuxi214023,China.E-mail: 18014924193@163.com)

AIM: To investigate the expression of serine-arginine-rich splicing factor 9/serine-arginine-rich protein 30c (SRSF9/SRp30c) and glucocorticoid receptor β (GRβ) in the glioma cells and the relationship of them.METHODSSmall interfering RNA (siRNA) was used to knock down the expression ofSRSF9 in the U87 cells. Short hairpin RNA (shRNA) derived from lentivirus was used to establish U87 stable knockdown cell line. Fluorescence microscopy was used to observe and detect transfection efficiency. The expression of GRβ and SRSF9/SRp30c at mRNA and protein levels was determined by RT-qPCR and Western blot. The cell viability, colony formation ability and migration ability were measured by CCK-8 assay, colony formation assay and wound healing experiment.RESULTSThe mRNA and protein levels of SRSF9/SRp30c and GRβ in the U87 cells were both down-regulated after knockdown ofSRSF9 (P<0.05). Fluorescence microscopic observation showed that a stable cell line was constructed successfully, and the transfection efficiency exceeded 80%. After knockdown ofSRSF9 expression in the U87 cells, the cell viability and colony formation ability were reduced (P<0.05). The migration ability was weakened significantly afterSRSF9 was knocked down (P<0.05).CONCLUSIONSRSF9/SRp30c may promote the proliferation and migration of the glioma cells by regulating GRβ.

Glioma; Glucocorticoid receptor β; Serine-arginine-rich splicing factor 9/serine-arginine-rich protein 30c; Cell proliferation; Cell migration

R363; R739.4

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.015

1000- 4718(2017)10- 1825- 06

2017- 04- 05

2017- 06- 13

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81372710)

△通訊作者 Tel:0510-85350363; E-mail: 18014924193@163.com

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