益氣溫陽活血化痰方通過抑制內質網應激對HHPH大鼠腦的保護作用*

項冰倩， 高 慧， 金曉潔， 戴雍月， 錢小英， 陳錫文， 王萬鐵△

(溫州醫科大學 1缺血/再灌注損傷研究所， 2實驗動物中心， 浙江 溫州325035； 3溫州市人民醫院呼吸內科， 浙江 溫州325000)

益氣溫陽活血化痰方通過抑制內質網應激對HHPH大鼠腦的保護作用*

項冰倩1， 高 慧1， 金曉潔1， 戴雍月1， 錢小英3， 陳錫文2△， 王萬鐵1△

(溫州醫科大學1缺血/再灌注損傷研究所，2實驗動物中心， 浙江 溫州325035；3溫州市人民醫院呼吸內科， 浙江 溫州325000)

目的評價益氣溫陽活血化痰方通過抑制內質網過度應激反應減輕大鼠低氧高二氧化碳性肺動脈高壓(HHPH)所致腦損傷的作用。方法雄性SD大鼠50只，采用隨機數字表法分為5組：對照組，低氧高CO2組，益氣溫陽活血化痰方低、中、高劑量給藥組。對照組置于常氧環境中飼養, 其余4組置于低氧高CO2氧倉中飼養，共飼養4周。益氣溫陽活血化痰方低、中、高劑量組大鼠每天分別按0.15 g/kg、0.3 g/kg和0.6 g/kg灌服益氣溫陽活血化痰方浸膏，低氧高CO2組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃。連續給藥4周后對大鼠進行手術，記錄肺動脈平均壓后進行心臟灌流，結束后開顱快速取腦組織檢測腦組織含水量并開胸取肺組織。光鏡下觀察腦組織及肺動脈形態學變化，TUNEL法檢測腦細胞凋亡指數，分光光度計法檢測腦組織caspase-3酶活性，Western blot和RT-PCR法檢測c-Jun氨基末端激酶(JNK)、caspase-12、C/EBP同源蛋白(CHOP)和葡萄糖調節蛋白78(GRP78)的蛋白及mRNA水平。結果與對照組相比，其余組肺動脈平均壓、腦含水量、細胞凋亡指數、caspase-3酶活性以及JNK、caspase-12、CHOP和GRP78的蛋白及mRNA均有升高，組織形態學結構亦有損傷性變化；與低氧高CO2組比較，益氣溫陽活血化痰方低、中、高劑量組的肺動脈平均壓、腦含水量、細胞凋亡指數、caspase-3酶活性以及JNK、caspase-12、CHOP和GRP78蛋白及mRNA均有降低，腦組織及肺組織結構損傷性的變化亦有明顯減輕，并以中劑量組最為顯著。結論益氣溫陽活血化痰方可能通過抑制內質網過度應激反應減輕HHPH所致的腦損傷。

益氣溫陽活血化痰方； 低氧血癥； 高二氧化碳血癥； 肺動脈高壓； 腦； 內質網應激

肺動脈高壓(pulmonary hypertension，PH)通常是指以肺動脈壓力升高為主，伴或不伴有小肺動脈病變為特征的惡性肺血管疾病，長期發展可引起右心衰，甚至導致死亡，是一類嚴重威脅人類身心健康的常見疾病[1-2]。近年來，PH與內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)關系的研究備受關注。缺血、缺氧可誘發ERS，適度的ERS可恢復細胞內環境穩態和維持細胞存活，但過度的ERS則會加重組織損傷，誘導ERS相關性細胞凋亡。有研究表明ERS參與慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的發生發展[3]。但其是否也參與了肺動脈高壓引起的腦損傷，目前尚未見有關報道。

益氣溫陽活血化痰方(Yiqi-Wenyang-Huoxue-Huatan formula，YWHHF)[4]由人參、黃芪、川芎、丹參、附片、法夏、薤白、白芥子等組成。大量研究表明組方中的黃芪、川穹、附片和丹參等對左心相關性PH有顯著的治療效果，能夠顯著改善患者咳、喘、痰以及心悸等癥狀，有效提高了患者的生活質量[5]。但是否對PH引起的腦損傷也有治療效果目前尚不清楚。本實驗采用吸入低氧伴高CO2混合氣體制備肺動脈高壓動物模型，研究益氣溫陽活血化痰方是否通過抑制內質網應激減輕低氧高二氧化碳性肺動脈高壓(hypoxia-hypercapnia pulmonary hypertension，HHPH)所致的腦損傷，同時為傳統中藥在臨床上的更好應用提供科學依據。

材 料 和 方 法

1動物

雄性健康SPF級SD大鼠50只，體重(200±20) g，由溫州醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號為SCXK (浙)2015-0009。采用隨機數字表法，將大鼠分為5組：對照組(control group,C組，n=10)，低氧高CO2組(模型組，model group，MO組，n=10)，益氣溫陽活血化痰方低劑量給藥組(L組，n=10)、中劑量給藥組(M組，n=10)和高劑量給藥組(H組，n=10)。

2主要試劑

YWHHF[4]為北京中醫藥大學組方，藥材購于老百姓大藥房；水合氯醛購自福建古田藥業有限公司；caspase-3酶活性檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒和 I 抗稀釋液購自碧云天生物技術研究所；逆轉錄試劑盒購自Thermo；兔抗大鼠葡萄糖調節蛋白78 (glucose-regulated protein 78，GRP78)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、p-JNK和caspase-12抗體購自Abcam；小鼠抗大鼠C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)抗體購自Cell Signaling Technology；辣根酶標記山羊抗兔 II 抗購自上海博蘊生物科技有限公司；TUNEL試劑盒購自Roche。所用引物由浩豐生物技術有限公司根據設計合成，見表1。

表1 RT-PCR的引物序列

3主要方法

3.1藥物制備 YWHHF全方組成為黃芪 30 g、人參20 g、附片9 g、川芎10 g、丹參10 g、法夏9 g、薤白12 g和白芥子 15 g，混勻浸泡1 h，多功能提取罐煎煮2次(加水量分別為藥材量的8倍和5倍，煎煮1.5 h、1 h)，合并2次濾液，真空冷凍干燥機干燥處理后得到干燥粉末，分裝，于陰涼處密封保存。按體表面積折算率換算成大鼠等效劑量。用生理鹽水分別配制高劑量組(200 g/L)、中劑量組(100 g/L)和低劑量組(50 g/L)，盡量現配現用，灌胃前用恒溫水浴鍋37 ℃水浴10 min。

3.2大鼠HHPH模型制備及實驗分組 依照文獻制備大鼠HHPH模型[6]。對照組置于常規環境，自由呼吸空氣，飼養4周；其余4組大鼠置于低氧高CO2(8.5%～11% O2、5%～6% CO2)氧倉中飼養，艙內水蒸汽用無水CaCl2吸收，每天8 h，每周6 d，其余時間常規環境飼養，共飼養4周；其中低、中、高劑量組大鼠根據體表面積折算率，每天進倉前半小時分別按0.15 g/kg、 0.3 g/kg和0.6 g/kg灌服YWHHF浸膏；低氧高CO2組大鼠進倉前0.5 h用等體積的生理鹽水灌胃。連續給藥4周后處死大鼠，用10%的水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射進行麻醉。用生理鹽水對心臟進行充分灌洗，灌洗結束后剪下大鼠頭顱并快速消毒，迅速開顱小心取出腦組織，漂洗干凈后保存做后續檢測。

3.3在體檢測大鼠肺動脈平均壓(mean pulmonary arterial pressure，mPAP) 75%乙醇行頸部皮毛消毒，剪開頸右半部皮膚2 cm至鎖骨上部，鈍性分離皮下組織和肌肉，暴露頸外靜脈游離約1 cm。在頸外靜脈中心處剪一個2～3 mm的“V”形切口，將連接PowerLab信號采集系統的PE導管沿著切口向里朝右心室方向推送，到達右心房后將導管朝外旋轉90度左右，邊旋轉邊前進，直至前進無阻力并出現波幅很大的心室波時，可判斷導管已進入右心室，將導管旋轉再往里推送，直至出現波幅較心室波小、波形較規則的肺動脈壓力波形，記錄肺動脈壓并保存。

3.4光鏡下腦和肺組織形態學觀察 開顱取出腦組織和開胸取出肺組織，取體積約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的腦和肺組織，經4%甲醛固定，常規進行石蠟包埋切片，HE染色后光鏡下觀察各組標本組織學改變。

3.5腦含水量檢測 實驗結束后開顱取腦組織稱其濕重，再放入烤箱內48 h后稱其干重。計算公式：腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

3.6TUNEL法檢測腦細胞凋亡指數 石蠟包埋腦組織并切片，依次經染色、二甲苯、無水乙醇、95%和75%乙醇、PBS漂洗后加入蛋白酶K溶液去除組織蛋白，蒸餾水漂洗后按照TUNEL試劑盒操作說明書進行操作，光學顯微鏡下觀察腦細胞凋亡程度。細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡細胞。每張切片隨機選擇10個高倍鏡視野(×400)記錄總細胞數和凋亡細胞數，并計算凋亡指數(apoptotic index，AI)=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

3.7Caspase-3酶活性的檢測 按每3～10 mg腦組織加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，冰上研磨成勻漿，轉移到1.5 mL離心管中冰中裂解5 min。4 ℃、20 000 r/min離心15 min后轉移上清液，按照caspase-3活性檢測試劑盒操作說明書進行操作，采用分光光度計法檢測腦組織中caspase-3的酶活性。

3.8Western blot法檢測腦組織p-JNK、GRP78、caspase-12和CHOP的蛋白水平 低溫下充分研磨腦組織，以400 μL RIPA(含4 μL PMSF) 裂解組織，混勻后吸取勻漿液4 ℃離心取上清，BCA蛋白定量試劑盒測蛋白濃度并繪標準曲線，樣品蛋白定量成2 g/L, 變性煮沸10 min。配膠進行電泳，上樣量20 μL，濕轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST漂洗，加 I 抗(JNK、p-JNK、GRP78、caspase-12和CHOP均以1∶1 000稀釋；GAPDH以1∶5 000稀釋)4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次7 min， II 抗室溫孵育1 h。TBST洗滌3次，每次5 min，加ECL工作液反應2 min，暗室曝光，顯影、定影后，凝膠分析軟件分析蛋白吸光度(A)。取目的蛋白條帶吸光度和內參照條帶吸光度的比值。計算p-JNK與JNK的比值，以反映p-JNK蛋白水平。

3.9RT-PCR檢測腦組織JNK、 GRP78、caspase-12和CHOP的mRNA表達水平 取大鼠腦組織加液氮研磨，以TRIzol法提取總RNA，測定RNA濃度，按照RT-PCR試劑盒說明書進行cDNA合成及擴增。PCR參數為：預變性 94 ℃ 3 min；變性 94 ℃ 30 s， 退火 (JNK 57.1 ℃， caspase-12 53 ℃， CHOP 59.3 ℃， GRP78 53.9 ℃， β-actin 51.3 ℃) 30 s， 延伸 72 ℃ 1 min，循環30次；終止延伸 72 ℃ 5 min。以β-actin為內參照，以目的基因條帶和內參照條帶灰度的比值反映其表達水平。RT-PCR結果用Quantity One分析。

4統計學處理

使用SPSS 19.0軟件進行分析，計量資料行正態性檢驗，實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多組樣本的均數比較先行方差齊性檢驗，方差齊性者，兩兩比較行SNK-q檢驗，方差不齊者行Dunnett’st檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1各組大鼠肺動脈平均壓變化

肺動脈平均壓結果顯示，與對照組相比，其余4組肺動脈平均壓均有明顯升高(P<0.05)；與低氧高CO2組相比，3組用藥組的肺動脈平均壓均有不同程度下降，并以中劑量組下降最為明顯(P<0.05)；3組用藥組兩兩相互比較，中劑量組肺動脈平均壓下降最顯著(P<0.05)，低、高劑量組無明顯差異，見圖1。

Figure 1. The changes of mean pulmonary arterial pressure (mPAP) in each group. C： control； MO: model; L: low-dose YWHHF; M: middle-dose YWHHF; H: high-dose YWHHF. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsMO group;▲P<0.05vsM group.

圖1各組大鼠肺動脈平均壓的變化

2各組大鼠肺組織形態學的變化

光學顯微鏡下觀察肺中小動脈發現，對照組大鼠肺動脈平滑肌細胞分布均勻，厚薄一致；低氧高CO2組肺動脈平滑肌細胞增生明顯，中膜增厚,管腔有效面積減小，肺組織細胞排列紊亂不一；YWHHF低、中、高劑量組大鼠肺動脈平滑肌細胞增生均有減輕，管壁厚度均有不同程度減小，管腔面積有不同程度增大，3組比較中，以中劑量組肺動脈平滑肌細胞增生程度最輕，管壁厚度最小，管腔面積最大，見圖2。

3各組大鼠光鏡下腦組織形態學變化

光學顯微鏡下觀察發現，對照組大鼠腦組織結構正常；低氧高CO2組大鼠腦細胞間隙增大，水腫明顯，胞質疏松、淡染，并伴有部分細胞壞死；低、高劑量組大鼠腦細胞排列尚規則，體積稍大，水腫程度減輕，中劑量組大鼠腦細胞輕微腫脹，胞核變淺，細胞有輕度水腫現象，見圖3。

Figure 2. The morphological changes of pulmonary middle and small arteries in each group (HE staining，×40). A: control group; B: model group; C: low-dose YWHHF group; D: middle-dose YWHHF group; E: high-dose YWHHF group.

圖2各組大鼠肺中、小型動脈組織形態學變化

4各組大鼠腦含水量的變化

與對照組相比，其余4組大鼠腦含水量均有升高(P<0.05)；與低氧高CO2組相比，3個用藥組大鼠腦含水量均有不同程度下降，并以中劑量組下降最為明顯(P<0.05)；3個用藥組兩兩相互比較，中劑量組腦含水量下降最顯著(P<0.05)，低、高劑量組間差異無統計學顯著性，見圖4。

5各組大鼠腦細胞凋亡指數的變化

與對照組相比，其余4組大鼠的腦細胞凋亡指數均有較明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與低氧高CO2組相比，3組用藥組大鼠的腦細胞凋亡指數均明顯降低(P<0.05)，3組用藥組兩兩相互比較，中劑量組降低最為明顯(P<0.05)，低、高劑量組間差異無統計學顯著性，見圖5。

Figure 3. The morphological changes of brain tissue in each group (HE staining). A: control group; B: model group; C: low-dose YWHHF group; D: middle-dose YWHHF group; E: high-dose YWHHF group.

圖3各組大鼠光鏡下腦組織形態學變化

Figure 4. The changes of brain water content in each group. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsMO group;▲P<0.05vsM group.

圖4各組大鼠腦含水量的變化

6各組大鼠caspase-3酶活性的變化

與對照組相比，其余4組大鼠caspase-3酶活性均有升高(P<0.05)；與低氧高CO2組相比，3個用藥組caspase-3酶活性均有不同程度下降，并以中劑量組最為明顯(P<0.05)；3個用藥組兩兩相互比較，中劑量組caspase-3酶活性降低最顯著(P<0.05)，低、高劑量組間差異無統計學顯著性，見圖6。

7各組大鼠腦組織p-JNK、caspase-12、CHOP和GRP78蛋白水平的變化

與對照組相比，其余4組大鼠p-JNK、caspase-12、CHOP和GRP78蛋白表達水平均有升高(P<0.05)；與低氧高CO2組相比，3個用藥組均有不同程度下降，并以中劑量組最為明顯(P<0.05)；3個用藥組兩兩相互比較，中劑量組p-JNK、caspase-12、CHOP和GRP78蛋白表達量降低最顯著(P<0.05)，低、高劑量組間差異無統計學顯著性，見圖7～10。

8各組大鼠腦組織JNK、caspase-12、CHOP和GRP78的mRNA表達水平變化

與對照組相比，其余4組大鼠JNK、caspase-12、CHOP和GRP78的mRNA表達水平均有升高(P<0.05)；與低氧高CO2組相比，3組用藥組均有不同程度下降，并以中劑量組最為明顯(P<0.05)；3組用藥組兩兩相互比較，中劑量組JNK、caspase-12、CHOP和GRP78的mRNA表達量降低最顯著(P<0.05)，低、高劑量組間差異無統計學顯著性，見圖11～14。

討 論

COPD是我國慢性肺心病的主要發病原因，HHPH是COPD發展到肺心病的中心環節，是肺心病特征性改變，HHPH的產生及嚴重程度明顯影響著COPD和肺心病的病程和預后[7-8]。肺動脈高壓的主要病理生理過程是肺動脈內皮細胞及肺動脈平滑肌細胞增殖導致的肺血管重構，肺血管阻力增加，最終引起右心衰竭等一系列病變[9-11]。肺動脈高壓的誘因如缺氧、病毒感染、炎癥等都與某種程度的ERS相關。最新研究表明ERS及其介導的細胞凋亡與肺動脈內皮細胞凋亡、肺動脈平滑肌細胞增殖、內皮素1等均有密切關系，在慢性低氧性PH發生發展過程中起重要作用[6]。而減輕ERS對左心肥厚和衰竭有保護作用。在PH動物模型中，減輕ERS可以降低肺血管阻力、肺血管重構和右心肥大，從而防治PH[12-15]，但ERS是否參與肺動脈高壓引發的腦損傷目前尚不明確。

從中醫角度講，腦缺血的主要病因是氣虛血瘀，治療應當益氣活血[16]。益氣溫陽活血化痰方由人參、黃芪、川芎、丹參、附片、法夏、薤白、白芥子等組成。方中人參取其“培土生金”之意，其重用人參，大補元氣，復脈固脫，生津安神，亦歸脾、肺二經，可通補胸中宗氣，即心肺之陽，為君藥，黃芪補肺益氣扶正以固其本，有補氣以助血行之意；川芎和丹參為“血中氣藥”，具有行氣活血之效為臣藥，祛瘀導滯，使百脈暢通，痹阻消散，去除胸中煩滿郁結；法夏和白芥子降氣化痰，行水消腫；附片和薤白等壯元陽，補氣血，有理氣寬胸之功，使痰得溫則化，瘀得陽則活。諸藥配合共奏益氣溫陽、活血化痰、開胸除痹之功。

Figure 5. The images of TUNEL staining (×200) and the changes of apoptotic index in each group. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsMO group;▲P<0.05vsM group.

圖5TUNEL染色檢測各組大鼠腦細胞凋亡指數的變化

Figure 6. The changes of caspase-3 activity in each group. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsMO group;▲P<0.05vsM group.

圖6各組大鼠caspase-3酶活性的變化

Figure 7. The protein level of p-JNK in each group determined by Western blot. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsMO group;▲P<0.05vsM group.

圖7Westernblot法檢測p-JNK蛋白水平的變化

Figure 8. The protein level of caspase-12 in each group determined by Western blot. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsMO group;▲P<0.05vsM group.

圖8Westernblot法檢測caspase-12蛋白水平的變化

Figure 9. The protein expression of CHOP in each group determined by Western blot. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsMO group;▲P<0.05vsM group.

圖9Westernblot法檢測CHOP蛋白水平的變化

Figure 10. The protein expression of GRP78 in each group determined by Western blot. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsMO group;▲P<0.05vsM group.

圖10Westernblot法檢測GRP78蛋白水平的變化

Figure 11. The mRNA expression of JNK in each group detected by RT-PCR. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsMO group;▲P<0.05vsM group.

圖11RT-PCR法檢測JNK的mRNA表達

Figure 12. The mRNA expression of caspase-12 in each group detected by RT-PCR. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsMO group;▲P<0.05vsM group.

圖12RT-PCR法檢測caspase-12的mRNA表達

Figure 13. The mRNA expression of CHOP in each group detected by RT-PCR. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsMO group;▲P<0.05vsM group.

圖13RT-PCR法檢測CHOP的mRNA表達

Figure 14. The mRNA expression of GRP78 in each group detected by RT-PCR. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsMO group;▲P<0.05vsM group.

圖14RT-PCR法檢測GRP78的mRNA表達

中醫學通過其特有的整體觀念及辨證論治，對腦損傷的治療具有一定優勢，療效明顯[5]。大量研究表明[17]，組方中的丹參素能夠增加微循環血流，清除氧自由基，保護線粒體，改善能量代謝；川芎能降低血液黏度，擴張小動脈，對腦缺血的修復有重要作用。丹參、川芎嗪配合使用能明顯提高腦基底動脈平滑肌細胞缺氧/復氧損傷后的存活率，且對正常腦基底動脈平滑肌細胞沒有影響。人參的活性成分人參皂甙對心肌及腦缺血再灌注損傷有很好的保護作用，也可明顯延長低壓和常壓缺氧條件下小白鼠的存活時間[18]；黃芪能增強神經細胞對葡萄糖的利用，改善腦缺血后腦組織能量代謝，對抗腦缺血再灌注損傷，并且對缺氧腦微血管內皮細胞損傷亦有保護作用[16]。諸藥合用，不僅可以顯著提高臨床療效，同時對運動耐量和減輕神經功能損傷、抗氧化有顯著作用，還可以有效地緩解中醫臨床癥狀。但益氣溫陽活血化痰方對肺動脈高壓引發的損傷腦組織是否具有保護作用及具體可能作用機制目前尚不明確。

本實驗的4種檢測蛋白為內質網應激相關蛋白，其中GRP78是一種位于內質網內的鈣離子結合分子伴侶，當細胞發生ERS時，GRP78會大量表達從而與內質網中錯誤折疊和未折疊蛋白結合，維持內環境穩定，對組織起到保護性作用。因此，GRP78表達的急速上調被認為是ERS 最敏感的標志物[19-20]。 JNK信號通路是ERS的凋亡途徑之一。有研究表明， 在低氧高CO2性肺動脈高壓損傷過程中JNK發生過度激活，而抑制JNK激活可明顯減少細胞凋亡，減輕肺動脈高壓損傷[21-23]。Caspase-12廣泛存在于大鼠的各組織中，是ERS的主要凋亡信號分子之一。過度的ERS可引起其它caspase家族如caspase-9和caspase-3的活化，最終導致細胞凋亡的發生[24]。CHOP是促凋亡的重要信號分子，是ERS特異的轉錄因子，被認為是內質網應激的標志物[25]。

本實驗研究結果顯示，除對照組外，其余4組大鼠肺動脈平均壓均有不同程度的升高，并且肺動脈平滑肌細胞亦有不同程度的增生，中膜增厚，表示肺動脈高壓模型已成功復制。腦組織光鏡結果顯示，與對照組相比，其余4組腦組織均有損傷性的結構改變，其中以低氧高CO2組損傷最明顯，3組用藥組組織學損傷明顯減輕，并以中劑量組減輕最明顯。在腦含水量、TUNEL染色、caspase-3酶活性檢測、Western blot及RT-PCR檢測中，與對照組比較，其余4組的腦含水量，細胞凋亡指數，caspase-3酶活性，JNK、caspase-12、CHOP和GRP78的蛋白及mRNA表達量均有升高，并以低氧高CO2組升高最明顯，3組用藥組與低氧高CO2組相比以上指標均有明顯降低，并以中劑量最顯著，以上結果說明低氧高CO2性肺動脈高壓的確引發了內質網應激并造成腦組織的損傷，而益氣溫陽活血化痰方能明顯降低腦組織損傷性因子的表達，減輕腦組織學損傷性結構的改變，對腦組織起到了有效的保護作用，并以中劑量組最適宜。

綜上所述，益氣溫陽活血化痰方可能通過抑制內質網過度應激反應而減輕低氧高CO2性肺動脈高壓引起的腦組織損傷。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

ProtectiveeffectofYiqi-Wenyang-Huoxue-HuatanformulaonHHPHratbrainbysuppressingexcessiveendoplasmicreticulumstress

XIANG Bing-qian1, GAO Hui1, JIN Xiao-jie1, DAI Yong-yue1, QIAN Xiao-ying3, CHEN Xi-wen2, WANG Wan-tie1

(1InstituteofIschemia/ReperfusionInjuryResearch,2AnimalExperimentCenter,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China;3DepartmentofRespiratoryMedicine,WenzhouPeople’sHospital,Wenzhou325000,China.E-mail:wwt@wmu.edu.cn)

AIM: To investigate whether Yiqi-Wenyang-Huoxue-Huatan formula (YWHHF) attenuats brain injury induced by hypoxia-hypercapnia pulmonary hypertension (HHPH) in the rats by inhibiting excessive endoplasmic reticulum stress response.METHODSHealthy SPF male SD rats (n=50) were randomly divided into 5 groups: control group, hypoxia-hypercapnia group, low-dose YWHHF group, middle-dose YWHHF group and high-dose YWHHF group. The rats in control group lived in normal environment, while the rats in other 4 groups were raised for 4 weeks in oxygen tank with low oxygen concentration and high CO2concentration. YWHHF was perfused in the rats of low-, middle- and high-dose groups at 0.15, 0.3 and 0.6 g/kg daily, respectively. The rats in hypoxia-hypercapnia group were given isometric distilled water. The surgery was performed on the rats after 4 weeks, and the brain and lung tissues were quickly collected to detect brain water content and observe the morphological changes after mean pulmonary artery pressure recording and heart perfusion. The caspase-3 activity and the apoptotic index of the brain cells were determined. The expression of c-Jun N-terminal kinase (JNK), caspase-12, C/EBP homologous protein (CHOP) and glucose-regulated protein 78 (GRP78) at protein and mRNA levels in brain tissues was detected by Western blot and RT-PCR.RESULTSCompared with control group, mean pulmonary artery pressure, brain water content, brain apoptotic index, caspase-3 activity, and the protein and mRNA levels of JNK, caspase-12, CHOP and GRP78 in the rest 4 groups were increased, and the brain and lung tissues had obvious damage under light microscope. Compared with hypoxia-hypercapnia group, mean pulmonary artery pressure, brain water content, brain apoptotic index， caspase-3 activity, and the protein and mRNA expression of JNK, caspase-12, CHOP and GRP78 in low-, middle- and high-dose YWHHF groups were decreased, and the pathological damage of the brain and lung tissues was obviously reduced under light microscope. These changes in middle-dose YWHHF group were the most significant.CONCLUSIONYWHHF effectively relieves the brain injury induced by HHPH in rats, which may be associated with inhibiting excessive endoplasmic reticulum stress response.

Yiqi-Wenyang-Huoxue-Huatan formula; Hypoxia； Hypercapnia; Pulmonary hypertension; Brain; Endoplasmic reticulum stress

R285.5； R544.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.005

1000- 4718(2017)10- 1759- 09

2017- 03- 30

2017- 06- 05

浙江省中醫藥重點研究項目(No. 2018ZZ018); 溫州市高層次人才創新技術重點資助項目(No. 2016-07)

△通訊作者 陳錫文 Tel: 0577-86689827; E-mail: wzqxy31et@126.com; 王萬鐵 Tel: 0577-86689817； E-mail： wwt@wmu.edu.cn

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