四種食源性肽改善光老化大鼠皮膚皺紋及屏障功能的實驗研究

徐德峰++馬忠華++趙謀明++張婷++蘇國萬++段軍毅

[摘要]目的：評價四種食源性肽口服暴露對SD大鼠光老化皮膚皺紋及屏障功能的改善效果。方法：將112只健康成年雌性SD大鼠隨機平均分為空白對照組、模型組、肽樣品組，每種肽分別設定低、中、高劑量組，配制濃度為0.3、0.9、1.5g/L的含肽水溶液進行口服，每日自由飲用；空白組不施行紫外輻照，模型組及肽樣品組均行UVA+UVB聯合輻照，連續輻照18周后進行皮膚表觀皺紋評分，檢測皮膚表皮水分含量和油脂含量，評價4種食源性肽對光老化大鼠皮膚皺紋和屏障功能的改善效應。結果：與正常對照組相比，模型組大鼠皮膚皺紋感官質量顯著降低，肽口服干預后可不同程度改善皮膚皺紋狀況，且總體呈劑量-效應關系，不同活性肽之間改善效果差異較大，以樣品2高劑量組效果最好；從屏障功能來看，模型組大鼠皮膚水分和油脂含量顯著低于空白組（P<0.05）；4種活性肽口服干預后光老化皮膚水油屏障功能恢復良好，樣品2和核桃肽中、高劑量時可顯著提升表皮水分和油脂含量（P<0.05）。結論：樣品2能顯著減少光老化大鼠皮膚深大皺紋量，改善受損皮膚屏障功能，是口服抗皺活性肽產品開發的首選基料。

[關鍵詞]活性肽；口服；SD大鼠；光老化；屏障功能

[中圖分類號]R758.14 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2017）09-0049-05

Comparative Analysis of Four Kinds of Food-derived Peptides with Oral Supplementation on the Wrinkling and Barrier Function Status in Photoaging

Skin of SD Rat

XU De-feng1，2，MA Zhong-hua1，ZHAO Mou-ming2，ZHANG Ting1，SU Guo-wan2，DUAN Jun-yi3

[1.Technique Center of Infinitus （China） Co. Ltd.，Guangzhou 510665，Guangdong，China； 2.College of Light Industry And Food Science Technology，South China University of Technology，Guangzhou 510640，Guangdong，China； 3.College of Agriculture and Animal Husbandry，Tibet University， Linzhi 86000， Tibet，China]

Abstract： Objective To evaluate the improvement of four kinds of food-derived peptides with oral supplementation on wrinkling and barrier function status of SD rat photoaging. Methods 112 of healthy adult female SD rats were randomly divided into normal control group， ultraviolet exposed group and peptides administration groups. Except the normal group， all animals in model and peptides administration groups were exposed to radiation of UVA in companying with UVB. The low， middle and high-dose bioactive peptides administration were obtained by preparing the water solution of peptides with concentration of 0.3， 0.9 and 1.5g/L respectively. And then the obtained peptides solution was orally administrated to the SD rats in peptides treating groups as the sole drinking source. The model and peptides groups were exposed to UV irradiation thrice weekly for 18 weeks until the photoaging model was established and then the improvement of four kinds of food-derived peptides on wrinkling and barrier function was evaluated by sensory scoring and operatically detection. Results In comparison with the rats in normal control group， the animals in model groups had remarkable wrinkling formation and this degradation in wrinkling status was improved by oral supplementation of peptides and the effectiveness was in a dose-effect manner and dependent on the kind and concentration of， of which the sample of peptides 2 exhibited most distinguished wrinkling elimination. Furtherly， judging from the water and oil barrier function of skin， the moisture and lipid concentration of skin in model group were significantly lower than those in normal group and the barrier function was desirable improved by oral supplementation of peptides （P<0.05）. At middle and high dose， the sample 2 and peptides significantly enhanced the moisture and lipid concentration of skin （P<0.05）. Conclusion Sample 2 can remarkably eliminate the deep and huge wrinkles and restore the barrier function in photoaging skin of SD rats， and thus to be the element ingredient for developing an anti-wrinkling product with peptides.endprint

Key words： peptides； oral supplementation； SD rats； photoaging； barrier function

皮膚老化與抗衰老是當今皮膚科學的研究熱點，紫外線輻射引起的皮膚光老化是皮膚外源性衰老的主要原因[1]。光老化導致皮膚過早出現粗糙、皺紋、色素異常、脆性增加、毛細血管擴張及皮革樣外觀等癥狀，嚴重影響皮膚外觀，導致皮膚屏障功能受損[2-4]。隨著審美標準的不斷提高，人們對皮膚光老化的防治越來越重視，鑒于皮膚組織的天然“磚墻結構”的致密屏障，只有分子量小于3 000Da以下的分子才能透皮吸收，而且功效成分大多化學結構穩定性較差，長時間暴露于紫外線等環境中極易分解，失去本身應有的抗衰功能甚至產生有毒物質[5]。因此，通過飲食等內在途徑改善皮膚屏障功能，減少皮膚皺紋量，從而改善光老化皮膚表觀形態已是新一代抗衰功能食品開發的必然趨勢。本研究對四種食源性肽進行口服實驗，根據光老化皮膚皺紋改善及屏障功能恢復情況，篩選最佳食源性肽，為抗衰產品開發奠定實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑：健康雌性SPF級SD大鼠168只購自廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，周齡10周，體質量180～200g，實驗動物生產許可證號：SCXK（粵）2011-0029，質量合格證號：No.44008500003344。

食源性肽樣品1、2、3由無限極（中國）有限公司技術中心提供（樣品1為狹鱈皮膚膠原蛋白肽，購自廣州維晟生物科技有限公司；樣品2為牛源彈性蛋白肽，由無限極（中國）有限公司技術中心自制；樣品3為鰹魚動脈球彈性蛋白肽，購自 Hayashikane Sangyo Co，.Ltd），核桃肽由華南理工大學趙謀明教授惠贈。新鮮基礎鼠糧及清潔刨花墊料購自廣州市花都區實驗動物養殖場。

1.2 主要設備：紫外光輻照箱為本實驗室自行設計安裝[6]，已獲專利授權（專利號：ZL201520152906.5）。紫外線燈管：UVA Philips 340-40WT12-G13，波長范圍320～400nm，波峰340nm；UVB Philips 313-40WT12-G13，波長范圍300～320nm，波峰313nm。UV-A型、UVB297型紫外輻照計購自北京師范大學光電儀器廠。大鼠實驗籠購自蘇州市蘇杭科技器材有限公司。FC1502菲斯·凱爾皮膚分析儀來自深圳凱爾電子廠。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與模型建立：SD大鼠飼養在專用鼠籠中，環境設施符合試驗動物SPF級等級要求，室溫20℃～25℃，濕度40%～70%，自然晝夜交替。動物實驗遵守實驗動物倫理學要求，大鼠適應性喂養1周后，最終選取112只健康SD大鼠隨機分為14組，正常對照組、模型組和肽樣品組（4種肽樣品分為設置低、中、高劑量組），每組8只，各組大鼠分2籠飼養，每籠4只。正常對照組與模型組以清潔自來水為唯一飲用水，肽樣品低、中、高劑量組分別在清潔自來水中分別加入終濃度0.3、0.9、1.5g/L的樣品1、2、3及核桃肽，飼料均為基礎飼料，自由攝食。

正常對照組不進行輻照，其余各組進行等量紫外輻照。參照文獻[6-9]，用記號筆畫出背部脊柱兩側約5.0cm×5.0cm區域并用電推剪剃除毛發，每次輻照前剃毛并進行Na2S化學脫毛，將脫毛大鼠放入自制固定器中暴露背部剃毛皮膚，連同固定器和大鼠置于紫外線光源（UVA+UVB）正下方40cm處進行紫外輻照，紫外輻照計測得該處UVA強度為177.9mW/cm2，UVB強度為59.6mW/cm2。輻照頻率為隔天輻照1次，時間為第1周10min/d，第2周20min/d，第3周30min/d，之后維持在30min/d，第18周皮膚外觀呈典型老化狀態表示造模結束，累計照射劑量為UVA 150.88J/cm2，UVA 78.67J/cm2，紫外輻照結束后對各組大鼠進行觀察拍照。

1.3.2 皮膚表觀皺紋測定評分：參照文獻資料[10]，根據皮膚橫向皺紋的情況對光老化程度和改善效果進行評分，評分依據見表1。

1.3.3 皮膚屏障功能測定：皮膚屏障功能評價采用皮膚表皮水分含量和油脂含量進行量化，FC1502菲斯·凱爾皮膚分析儀進行測定，具體按照儀器說明書進行操作，采用點觸式測量，測3次取平均值。

1.4 統計學分析：使用SPSS16.0軟件對數據進行統計分析，實驗數據以均數±標準差（x?±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊時采用LSD檢驗法，方差不齊時采用Dunnetts T3 進行比較，P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 SD大鼠皮膚光老化動物模型建立結果：光照前大鼠皮膚光滑，色澤正常，有彈性，無明顯皺紋。連續輻照，從第4周開始出現少許紅斑、脫屑，并可見少量橫向較淺皺紋，隨造模時間延長，皺紋逐漸加深，紅斑炎癥反應在第10周左右達到高峰，之后炎癥反應有所減輕，而皺紋、干燥、松弛持續加重，18周時可見明顯而持久的橫向皺紋，皮膚松弛、缺乏彈性、干燥粗糙，伴有脫屑、角化過度，色澤黯淡、部分存在色素異常，嚴重者呈皮革樣外觀，表明成功構建了SD大鼠皮膚光老化動物模型。見圖1。

2.2 各組SD大鼠皮膚外觀觀察及評分結果：由圖2A可以看出，與正常對照組相比，模型組SD大鼠皮膚表皮粗糙、皺紋明顯，呈典型皮革樣外觀，表明造模成功。與模型組相比，4種食源性肽對皮膚光老化均呈現出一定的修復效果，整體呈現一定的量效關系，但不同樣品的效果存在明顯差異：①低劑量時各肽樣品效果均不明顯；②中劑量時各樣品修復效果差異明顯，樣3組外觀無明顯改變，樣1有輕微改善；③高劑量時樣1和樣3皮膚橫向粗大皺紋雖有輕微改善，但不如樣2和核桃肽改善明顯。

由圖2B可知，模型組感官分值低于2.0，顯著低于空白對照組（P<0.05），而肽干預后光老化皮膚皺紋分值基本呈量-效關系提高，但不同樣品其提升效果差異較大，尤其在中、高劑量時其差異可達到顯著性水平。在中劑量時，樣2感官分值可達到4.1，顯著高于其他三種活性肽（P<0.05），在高劑量時樣2分值基本不再增加，而核桃肽此時達到3.8，接近樣2效果。綜合表觀形態及皺紋等級量化評分結果可知，樣品2和核桃肽在改善光老化皮膚皺紋方面效果最為顯著。endprint

2.3 各組SD大鼠皮膚屏障功能測定結果：由圖3A可以看出，與正常對照組相比，模型組SD大鼠皮膚在光老化造模過程中表層水分含量顯著降低（P<0.05），表明皮膚水屏障功能嚴重受損，與模型組相比，不同食源性活性肽口服干預后水屏障功能有不同程度恢復，且水分含量總體呈量-效關系上升，但不同肽其改善效果差異明顯。樣品2在低劑量時就可明顯提高皮膚角質層含水量，在中、高劑量時達到顯著性水平（P<0.05），核桃肽效果次之，但樣1和樣3雖然也呈量-效關系改善皮膚水分含量，但效果顯著低于樣2和核桃肽。與水分含量提升類似，活性肽口服干預后對光老化皮膚表層油脂含量也呈一定的量-效性提高。在低劑量時基本對油脂含量沒有影響，中、高劑量時樣2和核桃肽可顯著提升油脂含量（P<0.05），且樣2顯著優于其他樣品（圖3B）。

3 討論

目前皮膚光老化機制尚不明確，建立光老化動物模型對研究光老化機制和治療光老化疾病有著重要意義。鑒于SD大鼠具有價格低廉、適用性廣、取材面積大等優點[8-9]，本研究以SD大鼠進行光老化造模，結果表明經連續18周低劑量UVA+UVB聯合輻照成功復制了光老化動物模型，與文獻報道的動物模型表觀形態基本相同[8，11]，為功效評價和機制解析奠定了基礎。

相關研究表明[12-14]，口服VC、VE、多酚類等具有抗氧化活性的物質可增強抗皮膚組織氧化酶活性，調整免疫水平，減輕或修復光老化皮膚氧化損傷。自Mellander 1950年首次揭示食源性生物活性肽具有生物活性以來，食源性生物肽的生物功能就一直引起科學家的興趣和關注，生物肽的多種生物功能已被報道，其中改善人和動物皮膚老化功能也逐漸被報道[4，15-17]。Proksch[15]對114名年齡45～65歲女性隨機接受2.5g膠原蛋白肽或相應安慰劑連續8周口服暴露，通過雙盲實驗研究評價了膠原蛋白特定生物肽VERISOL（R）在控制眼瞼部位皮膚皺紋形成，刺激前膠原蛋白I、彈性蛋白、原纖蛋白生物合成方面的作用，證實口服特定生物肽BCP可減少皮膚皺紋，并對真皮基質合成有良好促進效果。基于食源性肽在改善皮膚光老化方面的良好應用前景，本次研究對四種典型食源性肽進行口服實驗，評價其對于光老化皮膚的改善效果。

皺紋及屏障功能是皮膚老化的主要指標之一，本研究參照相關文獻[10，18]，將形態學定性描述與感官評分相結合，使皺紋評價在缺乏專門儀器的情況下能夠進行量化評價，定量評價皮膚皺紋形態學的改變。等級量表可將單純肉眼觀察的現象量化，便于分析處理因素對研究對象的作用，亦可用于評判藥物療效，國外常用此類量表對皮膚的皺紋、松弛等狀態進行評估。采用光老化皮膚水分和油脂含量評價其屏障功能的恢復情況。結果表明，4種食源性肽均可在一定程度上改善皮膚光老化皺紋，修復皮膚光損傷，且存在種類和劑量差異，其中以樣品2高濃度效果最為明顯，其次是核桃肽和樣品1，樣品3表現最差，本研究結果為產品開發奠定了實驗基礎。

另，皮膚表觀狀態與皮膚水油屏障功能密切相關，良好的皮膚外觀取決于皮膚水分和油分屏障功能平衡。皮膚角質層細胞是抵御外界損傷的第一道防線，在光老化進程中，紫外線可通過紅斑形成、表皮增殖、色素沉著等方式對皮膚屏障功能產生影響，使角質層細胞間粘附能力降低，引起皮膚“磚墻結構”破壞，皮膚屏障功能受損，水分和油脂丟失率增加，從而引發和加劇表觀形態劣化[2-4，8]。本研究證明，與空白組相比，模型組大鼠皮膚水分和皮脂流失率顯著高于空白組，表明模型組大鼠皮膚的水和油脂屏障功能嚴重受損，活性肽口服干預后皮膚水分和油脂含量總體呈量-效關系上升，表明活性肽在不同程度上恢復了皮膚屏障功能。基于結構與功能的密切相關性，關于活性肽對皮膚結構的影響有待進一步深入研究。

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[收稿日期]2017-03-10 [修回日期]2017-06-27

編輯/張惠娟endprint