北冬蟲夏草蟲草素提取工藝研究

張鳳清 趙 麗 劉美善 崔林虎 滕 月 玄永男*

（1長春工業大學，吉林長春130014；2延邊林業科學研究院，吉林延吉133001）

北冬蟲夏草（Cordyceps militaris），別名蛹蟲草、北蟲草，隸屬于子囊菌亞門，麥角菌科、蟲草屬[1]，是蟲草屬的模式種。野生的北冬蟲夏草與冬蟲夏草具有相似的生物活性成分，主要包括蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、麥角甾醇、氨基酸、核苷類物質等，功效與冬蟲夏草相似[2-4]。

冬蟲夏草菌和北冬蟲夏草菌發揮藥理作用的物質基礎是產生多種生物活性物質，其中，最著名的就是蛹蟲草菌產生的蟲草素[5]，蟲草素具有抗菌、抗腫瘤、增強免疫力等多種生物功效，已引起國內外專家的極大關注。目前，已有不少以蟲草素為主的藥品、保健品及化妝品研發成果，如蟲草素膠囊、用于治療動脈粥樣硬化及抗抑郁的藥物等。而我國由蟲草素合成的治療白血病新藥也已進入Ⅰ期臨床階段[6]。試驗選擇桑蠶蛹為培養基質栽培得到的北冬蟲夏草進行蟲草素提取工藝的研究，以期為進一步進行蟲草素工業化提取提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑、設備蟲草素標準品，（純度＞98%）上海融禾醫藥科技有限公司。高效液相色譜：Agilent 1200 infinity Series美國Sigma公司。超高壓設備：HPP600 MPa/30 L，包頭科發高壓科技有限責任公司。其他試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液制備 精確稱取干燥至質量恒定蟲草素標準品4 mg于50 mL容量瓶中，用水溶解并定容作為標準儲備液，質量濃度為80 μg/mL。用超純水分別稀釋成2、5、10、20、40、80 μg/mL的蟲草素標準溶液。

1.2.2 樣品前處理 將蟲草原料置于40℃烘干箱中烘干，經粉碎機粉碎后過200目篩，精確稱取干燥至質量恒定的樣品0.50 g于50 mL離心管中，加入25 mL提取液后超聲提取，提取結束后將離心管置于20℃、5000 r/min的離心機中離心10 min，吸取上清液1 mL，經0.45 μm水相微孔濾膜過濾后直接注入進樣瓶以供分析。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：XBridgeTM C18（4.6 mm×250 mm，51 μm）；流動相：以乙腈-0.1%三氟乙酸溶液（取三氟乙酸600 μL加水配制成600 mL，（2∶98），流速為1.0 mL/min，進樣量為10 μL，進樣方式為自動進樣；柱溫為30℃，檢測波長為260 nm。

1.2.4 蟲草素標準曲線的繪制 取6個不同質量濃度的標準溶液渦旋振蕩充分混勻，用0.45 μm水相微孔濾膜過濾后直接注入進樣瓶。每個進樣重復3次，以蟲草素的質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。結果顯示，蟲草素均在2～801 μg/mL范圍內，質量濃度與峰面積呈現良好的線性關系，蟲草素的回歸方程為y=38505x+8952.2，r=0.9993。

1.2.5 提取方法優選

1.2.5.1 水熱回流法 精密稱取粉碎過60目篩的北冬蟲夏草10 g。置于80℃水浴鍋中提取3次，加水量分別為樣品重的10、8.8倍，提取時間為每次2 h，合并提取液過濾，收集濾液并定容至250 mL。

1.2.5.2 醇熱回流法 精密稱取粉碎過60目篩的北冬蟲夏草10 g，置于80℃水浴鍋中提取三次，加入75%乙醇量分別為樣品重的10、8.8倍，提取時間為每次2 h，合并提取液過濾，收集濾液并定容至250 mL。

1.2.5.3 超高壓萃取 精密稱取粉碎過60目篩的北冬蟲夏草10 g，準確加入250 mL 50%乙醇，密封混勻，300 MPa，5 min。

1.2.6 提取工藝條件優選

1.2.6.1 單因素試驗 溶劑體積分數：分別準確加入10%，30%，50%，70%，90%體積分數的乙醇500 mL；

固液比：精確稱定10 g樣品5份，以10、25、50、75、100倍分別加入70%乙醇。

壓力的選擇：精確稱定10 g樣品5份，分別加入70%乙醇1000 mL。密封混勻，加壓100、200、300、400、500、600 MPa。

1.2.6.2 正交試驗設計 在單因素試驗的基礎上，按照盡量減少試驗次數和尋求設計最優的原則，選擇提取壓力（A）、容積體積分數（B）和固液比（C）作為因素，每個因素各取3個水平，正交試驗方案見2.2.4。

2 結果與分析

2.1 不同方法提取蟲草素情況比較由表1結果可知超高壓萃取法的提取率遠高于其他兩種方法，故選擇超高壓萃取法為提取方法。

表1 不同提取方法對蟲草素提取率的影響

2.2 提取工藝條件優選

2.2.1 溶劑體積分數的選擇 隨著乙醇的體積分數逐漸增大，蟲草素隨之升高，而乙醇體積分數達到90%時，蟲草素的提取率明顯降低，因此選擇乙醇的最佳體積分數為30%～70%。

表2 超高壓萃取提取蟲草素的乙醇體積分數

2.2.2 固液比的選擇 由表3可以看出隨著固液比的增加蟲草素的提取率逐漸增加。但考慮到有效成分提取分離的后處理的工作量以及經濟性，選擇最佳固液比范圍為1∶25～1∶75。

2.2.3 壓力的選擇 由表4可見隨著提取壓力的提高，提取率逐漸升高，在100～500 MPa時，兩者呈線性正相關關系，當壓力達到600 MPa時，提取率有所降低，由此可得最佳壓力為100～500 MPa。

2.2.4 正交試驗設計方案及結果 結果表明，各因素對蟲草素提取率影響大小為A=C＞B，最佳試驗方案為A3B2C3，即提取壓力500 MPa、容積體積分數為50%，固液比1∶75、提取時間為2 min，追加試驗結果

表3 超高壓提取蟲草素的不同固液比

表4 超高壓提取蟲草素的不同壓力收率比較

表5 L9（34）正交試驗設計方案及結果

3 小結與討論

最佳提取工藝條件為使用超高壓提取方法，提取壓力500 MPa、容積體積分數為50%，固液比1∶75、提取時間為2 min，提取率達到5.5 mg/g。

超高壓技術在我國還處于起步階段，該技術在國內外主要應用于食品業，目的是為了防止食物的微生物污染、延長食品儲藏時間[7]。2004年吉林工業大學張守勤等[8]率先將該技術應用于中藥提取，隨后，在黃酮類[9，10]皂苷類[11，12]多糖類[13，14]等的提取中均得到了應用，結果表明其在有效成分提取方面具有許多獨特的優勢。超高壓提取在常溫下進行，該條件有助于對溫度敏感的成分的活性保持，適用范圍廣，提取時間短，一般只需1～20 min；提取效率高，提取產物雜質含量少，能夠明顯減少原料中的微生物含量，從而延長存放時間；提取過程中無溶劑的揮發，不會對環境造成污染，而且提取工藝簡單，機械化程度高，適宜由實驗室推廣到現代化大生產中[13]。

試驗以桑蠶蛹北冬蟲夏草為試驗對象，選用超高壓提取方法對蟲草素進行提取，全程只需要加壓的階段消耗電能，一次可以處理幾十千克物料，提取時間短，提取率高，是適合蟲草素工業化提取的綠色環保節能的提取工藝。