化濕行瘀清熱方治療金黃地鼠頰黏膜癌前病變后HSP90α、Ki-67的表達及意義

張鵬飛，劉 健，劉鐵軍， 許彥枝*

(1.河北省胸科醫院口腔科，河北 石家莊 050041；2.河北醫科大學第四醫院口腔科，河北 石家莊 050011)

·論著·

化濕行瘀清熱方治療金黃地鼠頰黏膜癌前病變后HSP90α、Ki-67的表達及意義

張鵬飛1，劉 健2，劉鐵軍2， 許彥枝2*

(1.河北省胸科醫院口腔科，河北 石家莊 050041；2.河北醫科大學第四醫院口腔科，河北 石家莊 050011)

目的探討金黃地鼠頰黏膜癌前病變經化濕行瘀清熱方治療前后熱休克蛋白(heat shock protein 90α,HSP90α)、Ki-67的表達及臨床意義。方法60只金黃地鼠用二羥甲基丁酸(dimethylolbutanoie acid，DMBA)丙酮溶液涂抹6周全部制作成金黃地鼠頰黏膜癌前病變的動物模型，隨機分成實驗組和對照組。實驗組30只應用化濕行瘀清熱方行灌胃療法8周，對照組30只應用生理鹽水灌胃8周，采用免疫組織化學SP法觀察2組口腔黏膜的形態變化，應用染色強度評價HSP90α、Ki-67的表達水平。結果灌胃后實驗組Ki-67陽性表達率為23.3%(7/30)，對照組Ki-67陽性表達率為80.0%(24/30)，2組差異有統計學意義(P<0.01)；灌胃后實驗組HSP90α陽性表達率為20.0%(6/30)，對照組HSP90α陽性表達率為76.7%(23/30)，2組差異有統計學意義(P<0.01)。結論化濕行瘀清熱方對DMBA誘發的金黃地鼠口腔黏膜癌前病變有一定的逆轉作用。

癌前狀態；熱休克蛋白質類；Ki-67；化濕行瘀清熱方

近年來，口腔黏膜癌前病變的發病率逐年提高。其發病原因涉及全身因素及局部因素。若口腔黏膜癌前病變可以被早期發現并進行積極治療，往往可以取得滿意的預后[1]。有研究發現化濕行瘀清熱方對口腔黏膜癌前病變有特定的治療作用[2]。二羥甲基丁酸(dimethylolbutanoieacid，DMBA)誘導的金黃地鼠頰黏膜癌是目前口腔腫瘤研究的理想模型。本研究采用DMBA誘導的金黃地鼠頰黏膜癌作為模型，模擬人口腔黏膜癌前病變的發生、發展過程，應用中藥化濕行瘀清熱方對金黃地鼠頰黏膜癌前病變進行處理，以免疫組織化學SP法檢測其治療前后熱休克蛋白(heatshockprotein90α,HSP90α)、Ki-67的表達，旨在探討中藥化濕行瘀清熱方對金黃地鼠口腔黏膜癌前病變的逆轉作用，報告如下。

1 材 料 與 方 法

1.1 動物模型的建立與分組 選取金黃地鼠60只，鼠齡6周，體質量260～300g， 雌雄比例1∶1。所有實驗動物單籠飼養，自由食水，在實驗室適應環境2d后用于實驗。實驗動物由河北省實驗動物中心提供，操作過程符合中華人民共和國科學技術部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》標準。60只地鼠頰黏膜用0.5%DMBA涂藥，每周3次，連續涂藥6周，建立口腔黏膜癌前病變動物模型。涂藥后禁食、水2h，口腔癌前病變標準符合1978年WHO對口腔癌前病變的判定標準：雙側頰黏膜肉眼觀全部為充血、糜爛、條索狀皺折等表現，HE染色后觀察可見不同程度的異常增生，表現為上皮結構異常，如過角化、粒層明顯、棘層增厚、基底細胞復層、核濃染、上皮釘突肥大等。60只金黃地鼠隨機分為：實驗組30只，應用化濕行瘀清熱方(主要由砂仁6g、佩蘭10g、黃柏10g、赤芍9g、紅花9g、蟬蛻10g等組成，每日1劑，分早晚2次服用)[3]灌胃治療，所需材料購自河北醫科大學第四醫院中藥房；對照組30只，進行生理鹽水灌胃處理。

1.2 灌胃與取材方法 實驗組灌胃前禁食、水8h，待動物停涂DMBA1周后，立即采取化濕行瘀清熱方灌胃療法1次/d。對照組應用生理鹽水灌洗。連續灌洗8周后，將動物處死于同側頰黏膜處切取相同大小(1.0cm×1.5cm×0.1cm)病變組織及相鄰的正常黏膜組織。用10%甲醛溶液將標本固定。

1.3 免疫組織化學染色 采用免疫組織化學SP法，按試劑盒說明操作。兔抗鼠Ki-67單克隆抗體和兔抗鼠HSP90ɑ單克隆抗體購自北京中杉金橋公司。二氨基聯苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色，蘇木精復染，封片后由2位資深病理科醫師在雙盲情況下評價隨機的5個高倍視野，每個高倍視野計數100個細胞。然后根據半定量積分法將染色強度分為4個級別：無著色，0分；淡黃色，1分；棕黃色，2分；棕褐色，3分。根據陽性細胞的百分比分5級：<5%為0分；5%～25%為1分；>25%～50%為2分；>50%～75%為3分；>75%為4分。每張切片最后的得分為2次評分相加所得的總分[0～1分計為(-)，2～3 分計為(+)，4～5分計為(++)，6～7分計為(+++)]。以(-)定位陰性，以(+)、(++)、(+++)分別定位弱陽性、陽性和強陽性。分別設立陰性對照及陽性對照：以PBS替代一抗的正常口腔黏膜上皮染色結果作為陰性對照；以試劑自帶陽性片染色結果作為陽性對照。

1.4 統計學方法 應用SPSS23.0統計軟件分析數據，等級資料比較采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 癌前病變模型的形態變化 未經DMBA丙酮接觸地鼠頰黏膜表面光滑呈淡粉色，透亮具有彈性，血管清晰，鏡下觀察可見角化的復層鱗狀上皮，薄層結締組織、纖維細胞及血管位于上皮和肌層之間(圖 1)。經DMBA丙酮溶液接觸6周后，肉眼觀可見雙側頰黏膜表現為充血、糜爛，HE染色后鏡下觀察地鼠頰黏膜可見不同程度的異常增生，表現為上皮結構異常。可見不規則分層的上皮、喪失極性的基底細胞、核分裂次數增加、異常淺層分裂及釘突內角化珠等；細胞核變大，形狀不規則且染色質增多，累及上皮層的下1/2～2/3(圖 2)。結果顯示，輕度異常增生24只，中度異常增生30只，重度異常增生6只。

免疫組織化學染色結果：HSP90α染色陽性呈棕黃色顆粒狀，主要表達于細胞核或細胞漿(圖3～5)；Ki-67染色陽性呈棕黃色顆粒狀，主要表達于細胞核，胞漿為陰性(圖6～8)。

圖1 地鼠頰黏膜在接觸DMBA之前的表現(HE染色×200)Figure1 Buccalmucosaofthecasesbe-forethecontactofDMBA(HE×200)圖2 地鼠頰黏膜在接觸DMBA之后的表現(HE染色×200)Figure2 BuccalmucosaofthehamstersaftercontactofDMBA(HE×200)圖3 接觸DMBA溶液之后HSP90α的表達(免疫組織化學×200)

Figure3TheexpressionofHSP90αaftercontactofDMBA(SP×200)

圖4化濕行瘀清熱方灌胃治療后HSP90α的表達(免疫組織化學×200)

Figure4TheexpressionofHSP90αaftergavageofHuashiXingyuQingredecoction(SP×200)

圖5生理鹽水灌胃治療后HSP90α的表達(免疫組織化學×200)

Figure5TheexpressionofHSP90αaftergavageofsaline(SP×200)

圖6接觸DMBA溶液之后Ki-67的表達(免疫組織化學×200)

Figure6TheexpressionofKi-67aftercontactofDMBA(SP×200)

圖7化濕行瘀清熱方灌胃治療后Ki-67的表達(免疫組織化學×200)

Figure7TheexpressionofKi-67aftergavageofHuashiXingyuQingredecoction(SP×200)

圖8生理鹽水灌胃治療后Ki-67的表達(免疫組織化學×200)

Figure8TheexpressionofKi-67aftergavageofsaline(SP×200)

2.2 2組地鼠治療前后Ki-67和HSP90α表達 2組地鼠接觸DMBA丙酮溶液成模后(治療前)，實驗組Ki-67陽性表達率為80.0%(24/30),對照組Ki-67陽性表達率為76.7%(23/30)，2組差異無統計學意義(P>0.05)；灌胃后實驗組Ki-67陽性表達率為23.3%(7/30)，對照組Ki-67陽性表達率為80.0%(24/30)，2組差異有統計學意義(P<0.01)。2組地鼠接觸DMBA丙酮溶液成模后(治療前)，實驗組HSP90α 陽性表達率為70.0%(21/30)，對照組HSP90α陽性表達率73.3%(22/30)，2組差異無統計學意義(P>0.05)；灌胃后實驗組HSP90α陽性表達率為20.0%(6/30)，對照組HSP90α陽性表達率為76.7%(23/30)，2組差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 2組經DMBA丙酮液體處理后SP90α和Ki-67表達情況Table 1 The expression of HSP90α and Ki-67 in two groups after the treatment of DMBA-acetone (n=30，例數)

3 討 論

口腔黏膜癌前病變是指細胞異常增生，具有惡性變化傾向。其發病與局部因素(吸煙、喜飲烈性酒、咀嚼檳榔、不良修復體、殘根殘冠的銳利邊緣對局部黏膜的機械刺激)的長期刺激以及某些全身因素(念珠菌感染、微量元素缺乏、微循環改變、易感的遺傳素質、脂溶性維生素缺乏等)有關。由于口腔黏膜癌前病變原因不明且易導致癌變，故早期對口腔黏膜癌前病變進行處理尤為重要。

目前，對于口腔黏膜癌前病變尚無特效治療方法，尤其是對于病變部位多發或病變面積較大的患者。西醫療效不穩定，僅能緩解臨床癥狀，無法從根本上解決問題。近年來，某些中草藥在治療口腔黏膜癌前中發揮了顯著的作用。國內部分學者對單玄口膠、1023中藥合劑、復方半枝蓮、復方絞股藍、增生平、燈盞細辛等中成藥及天然胡蘿卜素、大蒜、蘆薈、螺旋藻等天然保健食品防治口腔癌前病變作用進行了相應的研究[4]。化濕行瘀清熱方有清熱燥濕、健脾化濕、清熱涼血、質輕善散、止癢等功效。其中蟬蛻除含有17種氨基酸外，還包含多種人體不可缺少的微量元素，對促進口腔黏膜病變有特定的作用[5]；黃柏清熱涼血、健脾化濕，有抑菌抗炎、促進組織愈合的功效；佩蘭解熱清暑、健脾利濕，具有抗炎殺菌作用；甘草可以去除不正之氣及瀉火，健脾胃而和中，解百毒，協和諸藥；丹參、赤芍等可通過調節機體內部免疫系統達到自穩的狀態[3]，赤芍還可以在一定程度上降低血液黏度，改善微循環及血管通透性，進而促進上皮細胞的修復。化濕行瘀清熱方的上述優點對口腔黏膜癌前病變有一定的治療作用。

HSP90α基因位于人類染色體14q32.33，有11個外顯子，其編碼產物是732個氨基酸的蛋白質，相對分子質量為90 000。HSP90α的主要生物學功能包括“分子伴侶”作用、在細胞調節的“多成分伴侶”途徑中的作用、體外ATP酶活性及自我磷酸化作用、免疫功能和抗凋亡與凋亡調節作用等。其中免疫功能和抗凋亡、凋亡調節作用與腫瘤的發生密切相關[6-8]。作為腫瘤治療的一個重要靶點，HSP90α蛋白在維持多種腫瘤蛋白的正常結構、功能和穩定性方面均發揮著不可替代的作用。

Ki-67是在增殖細胞中表達的一種核抗原，基因位于10號染色體上[9-10]。它是一個大分子質量的蛋白，在除G0期外的細胞周期內表達，于細胞周期啟動時開始增加，在S期的后半部分表達顯著增強，于G2和M期達到峰值，在有絲分裂結束后又迅速下降[11-12]。其與細胞增殖過程有關。在人類諸多癌前病變中，均存在Ki67過度表達的現象[13]。因此，許多學者推斷Ki-67是人類所有增殖細胞中普遍存在的標志性抗原，且對組織細胞惡變的識別具有一定的意義。

本研究應用免疫組織化學方法檢測了HSP90α、Ki-67在各組中的表達情況。正常地鼠頰黏膜HSP90α、Ki-67的陽性表達主要見于基底細胞層[14-15]。DMBA致癌6周后，HSP90α、Ki-67的表達由基底層逐漸擴展至棘層，乃至上皮全層，進而使得HSP90α、Ki-67陽性表達率明顯升高，這種現象的發生與DMBA作用后上皮組織學變化的類型有關[16-17]。中藥化濕行瘀清熱方灌胃治療后HSP90α、Ki-67的陽性表達明顯降低，而生理鹽水灌胃治療后HSP90α、Ki-67陽性表達無明顯變化。表明化濕行瘀清熱方對金黃地鼠頰黏膜癌前病變有一定的逆轉作用。有研究發現HSP90α、Ki-67的表達與口腔黏膜癌前病變治療的進程呈正相關性[18]，但其具體作用機制尚有待于進一步深入探討。

總之，中藥化濕行瘀清熱方對DMBA誘發的金黃地鼠口腔癌前病變有一定的逆轉作用，其作用機制還不完全清楚，但隨著分子生物學技術和蛋白質組學在中藥研究方面的應用，中藥化濕行瘀清熱方的作用機制將會更明了。

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(本文編輯：許卓文)

TheexpressionsandsignificanceofHSP90αandKi-67ingoldenhamsterbuccalmucosaprecancerouslesionsafterHuashiXingyuQingredecoctiontreatment

ZHANGPeng-fei1,LIUJian2,LIUTie-jun2,XUYan-zhi2*

(1.DepartmentofStomatology,theChestHospitalofHebeiProvince,Shijiazhuang050041,China; 2.DepartmentofStomatology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China)

ObjectiveTo investigate the expressions and significance of heat shock protein 90α, HSP90α)and Ki-67 in hamster buccal mucosa precancerous lesions after Huashi Xingyu Qingre decoction treatment.MethodsSixty golden hamster models of buccal mucosa precancerous lesions were established after the contact of dimethylolbutanoie acid(DMBA) for six weeks. They were randomly divided into experimental and control groups. Thirty rats of experimental group were received gavage therapy of Huashi Xingyu Qingre decoction for 8 weeks, while, the other thirty rats of control group were received normal saline treatment for 8 weeks. The expression levels of HSP90α、Ki-67 were assessed by dyeing intensity of streptavidin-perosidase(SP).ResultsThe positive expression rate of Ki-67 after gavage was 23.3%(7/30) in the experimental group and 80.0%(24/30) in the control group(P<0.01). The positive expression rate of HSP90α after gavage was 20.0%(6/30) in the experimental group and 76.7%(23/30) in the control group(P<0.01).ConclusionHuashi Xingyu Qingre decoction is conspicuously effective in the reversal of DMBA-induced precancerous lesions in the hamster buccal mucosa.

precancerouslesions;heat-shockproteins;Ki-67;HuashiXingyuQingredecoction

R730.21

A

1007-3205(2017)10-1180-05

2017-02-17；

2017-04-18

河北省中醫藥管理局科研計劃(2016175)

張鵬飛(1981-)，男，山西運城人，河北省胸科醫院主治醫師，醫學碩士，從事口腔修復研究。

*通訊作者。E-mail：xu_yanzhi@163.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.10.015