阿霉素聯合熱療、程序死亡受體配體1抗體對膠質瘤細胞的影響

張海峰，鄭士亞，歐陽彬，楊登元，劉文慶，田繼輝*

(1.江蘇省南京市中心醫院外科，江蘇 南京 210000；2.東南大學醫學院腫瘤學系，江蘇 南京 210000；3.寧夏醫科大學附屬總醫院神經外科，寧夏 銀川750004)

·論著·

阿霉素聯合熱療、程序死亡受體配體1抗體對膠質瘤細胞的影響

張海峰1，鄭士亞2，歐陽彬1，楊登元1，劉文慶3，田繼輝3*

(1.江蘇省南京市中心醫院外科，江蘇 南京 210000；2.東南大學醫學院腫瘤學系，江蘇 南京 210000；3.寧夏醫科大學附屬總醫院神經外科，寧夏 銀川750004)

目的探討阿霉素聯合熱療、程序死亡受體配體1抗體對膠質瘤細胞的增殖抑制作用，以及阿霉素聯合熱療對U251膠質瘤細胞表面程序死亡受體配體1表達的影響。方法采用CCK-8法確定阿霉素的半抑制濃度。建立U251與T細胞共培養體系，采用CCK-8法檢測不同處理組(阿霉素組，熱療組，程序死亡受體配體1抗體組，阿霉素聯合熱療組，阿霉素聯合程序死亡受體配體1抗體組，熱療聯合程序死亡受體配體1抗體組，阿霉素聯合熱療、程序死亡受體配體1抗體組)的細胞增殖抑制率。采用流式細胞術檢測阿霉素聯合熱療對U251膠質瘤細胞表面程序死亡受體配體1表達的影響。結果阿霉素聯合熱療、程序死亡受體配體1抗體相比單一治療方法抑制細胞增殖能力更強；阿霉素聯合熱療可以上調膠質瘤細胞表面程序死亡受體配體1的表達。結論阿霉素聯合熱療、程序死亡受體配體1抗體是一種很有前景的聯合治療膠質瘤方式，可為未來進一步探索膠質瘤治療新策略提供實驗依據。

神經膠質瘤；免疫療法；溫熱療法；阿霉素

神經膠質瘤是最常見的原發性顱內腫瘤，大約占所有顱內腫瘤的50%，占所有原發性腦腫瘤的15%。目前，以手術切除為主的綜合治療是神經膠質瘤的主要治療方法，然而由于膠質瘤呈浸潤性生長，惡性程度高，增殖、遷移侵襲性強，膠質瘤患者的生存期仍然很短，預后不容樂觀[1]。因此，探索新的有效的治療方法至關重要。近10年來，免疫治療取得了突破性進展，這很大程度上歸功于免疫控卡點尤其是免疫負性調控點的發現[2-5]。基于程序死亡受體1(programmeddeath-1,PD-1)和程序死亡受體配體1(programmeddeathligand-1,PD-L1)的免疫治療成為免疫治療中的主力軍[6-7]。其對黑色素瘤、肺癌、腎癌、胃癌、結腸癌、卵巢癌、乳腺癌等均顯示出良好的效果[8-10]。但單用PD-1/PD-L1抑制劑還是不能使所有患者獲益。為此，本研究探索一種聯合治療模式，即PD-L1抑制劑聯合阿霉素聯合熱療，并觀察阿霉素聯合熱療對膠質瘤細胞PD-L1表達的影響，旨在為尋求膠質瘤有效的聯合治療方法提供理論依據。

1 資 料 與 方 法

1.1 細胞與試劑 人膠質瘤細胞株U251為東南大學附屬中大醫院外科研究所提供；RPMI1640培養基、胎牛血清均購自美國Gibco公司；鹽酸阿霉素由深圳萬樂藥業有限公司生產；PD-L1抗體購自Bioxcell公司；PE-PD-L1抗體購自Biolegend公司；CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 細胞傳代培養 人膠質瘤細胞U251培養于含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中培養，每3～5d更換培養液傳代。實驗采用對數生長期細胞。

1.3 藥物半抑制濃度(half-inhibitoryconcentration，IC50)的確定 離心收集U251細胞，用RPMI1640培養液稀釋成2×104個/mL的細胞懸液，接種至96孔板；阿霉素稀釋成8個濃度組(0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00mg/L)加入96孔板中。孵育48h后加入10μLCCK-8試劑，4h后取出96孔板，在450nm波長處測定各孔OD值，參比波長為650nm。計算各濃度組細胞活性率=實驗組OD值/對照組OD值×100%，繪制濃度-細胞活性率曲線并擬合方程，計算IC50。

1.4CCK-8法測定細胞增殖抑制率

1.4.1 外周血T淋巴細胞的制備 征得膠質瘤患者同意后，取其外周血。采用Ficoll密度梯度離心，1 800r/min，30min，小心吸取白膜層即獲得人外周單個核細胞，加入細胞因子CD28、IL-2，置于細胞培養箱孵育。

1.4.2U251與T細胞共培養體系建立 取制備好的人T細胞(1×105/孔)和U251細胞(2×104/孔)接種于96孔板，建立200μL/孔體系。

1.4.3 細胞分組 將U251與T細胞共培養體系分為8組：對照組、阿霉素組、熱療組、PD-L1抗體組、阿霉素聯合熱療組、阿霉素聯合PD-L1抗體組、熱療聯合PD-L1抗體組、阿霉素聯合熱療和PD-L1抗體組。其中對照組未予任何干預；阿霉素濃度選用IC50(4mg/L)；熱療采用電熱恒溫水浴箱加熱1h，溫度為43 ℃；PD-L1抗體濃度1.5mg/L。

1.4.4 細胞增殖抑制率檢測 各組于干預48h加入CCK-8試劑10μL/孔，酶標儀450nm處測定各孔OD值，參比波長為650nm。計算各組細胞增殖抑制率=(1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。

1.5 流式細胞術檢測U251細胞表面PD-L1的表達

1.5.1 細胞分組U251細胞(2×104/孔)接種于96孔板，細胞分為未干預組、阿霉素單藥組、單一熱療組、阿霉素單藥聯合熱療組。

1.5.2PD-L1表達檢測 各組作用48h后，胰酶消化處理，PE-PD-L1抗體避光孵育30min，PBS洗2次，上流式細胞儀檢測細胞表面PD-L1的表達。

1.6 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件處理數據。計量資料比較分別采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 阿霉素對膠質瘤細胞U251的IC50 采用不同濃度阿霉素作用于U251細胞，48h后觀察阿霉素對細胞增殖的影響，可見呈濃度依賴性，曲線呈反“S”形，IC50 的阿霉素濃度為4.298mg/L，后期實驗取4mg/L。

2.2 各組細胞48h增殖抑制率的比較 阿霉素單藥、PD-L1抗體單藥以及單獨應用熱療組對U251細胞均有增殖抑制作用；聯合用藥組較單藥組增殖抑制更為明顯(P<0.05)；在聯合組中，阿霉素+熱療+PD-L1抗體組的增殖抑制作用最強，達(92.2±4.5)%，提示三者有明顯協同作用。見表1。

表1 作用于U251細胞48 h后不同處理組細胞增殖抑制率比較Table 1 Cell proliferation inhibition rate of U251 cells after different treatment

*P<0.05與阿霉素單藥組比較 #P<0.05與熱療組比較 △P<0.05與PD-L1抗體組比較 ☆P<0.05與阿霉素+PD-L1抗體組比較 ▲P<0.05與阿霉素+熱療組比較 ★P<0.05與熱療+PD-L1抗體組比較(SNK-q檢驗)

2.3 各組細胞表面PD-L1的表達 未干預組PD-L1表達率為(65±8)%，阿霉素單藥作用后PD-L1表達率更加增高，阿霉素聯合熱療也可明顯上調PD-L1表達(P<0.05)；而單一熱療對PD-L1的表達影響不大(P>0.05)。見表2。

表2 處理后各組細胞表面PD-L1表達比較Table 2 The expression of PD-L1 after different treatment

*P<0.05與未干預組比較 #P<0.05與阿霉素單藥組比較(SNK-q檢驗)

3 討 論

膠質瘤是最常見的顱內惡性腫瘤之一。近年來，以手術、放療、化療和靶向治療為主的綜合治療均取得了一定進展，但膠質瘤患者的長期生存率仍然較低。研究發現，腫瘤細胞可通過免疫耐受和逃逸機制使得自身免受宿主防御機制的殺傷和清除，其中PD-L1與PD-1相互作用介導的負性協同刺激信號在腫瘤的免疫逃逸中發揮了至關重要的作用。PD-L1廣泛表達于多種腫瘤細胞，當受體與配體結合可抑制下游NF-κB的轉錄并促使干擾素-δ分泌的下調，最終抑制T細胞免疫，導致免疫抑制性腫瘤微環境形成，使腫瘤細胞逃避機體的免疫監控和殺傷。而阻斷PD-1/PD-L1信號通路可以逆轉腫瘤免疫微環境，恢復T細胞的抗腫瘤活性，從而增強內源性抗腫瘤免疫效應[11]。目前，美國FDA批準了2個具有劃時代意義的免疫治療藥物：針對PD-1的抗體Nivolizumab和Pembrolizumab，用于黑色素瘤和晚期非小細胞肺癌治療。針對PD-L1的抗體MPDL3280A在肺癌、黑色素瘤等臨床研究中也取得了可喜的成績[12-13]。免疫檢查點抑制劑的出現改寫了腫瘤治療的歷史，將腫瘤的藥物治療向前推進了一大步。這些成功的臨床案例為免疫檢查點抑制劑在膠質瘤中的應用提供了實踐基礎。盡管免疫檢查點抑制劑(抗PD-1、PD-L1單抗)在腫瘤藥物治療中取得了重大進展，但目前臨床上仍然面對兩大亟待解決的問題：①腫瘤患者的獲益人群仍然是有限的；②不能根治腫瘤，不能帶來徹底的臨床療效。對于前者，已經進行了大量的相關性因素分析，研究認為PD-L1高表達的患者其臨床獲益率更高；對于后者，原因復雜，可能與表觀遺傳學的改變、免疫基因突變等因素有關。為了進一步使免疫檢查點抑制劑在腫瘤治療中發揮更大的作用，很多學者開始探索免疫治療聯合其他傳統治療方法的新策略，以期進一步增大獲益人群、延長患者生存期[14-15]。

化療是腫瘤治療的重要手段之一，細胞毒性化療藥物能夠改變腫瘤微環境的免疫抑制情況。環磷酰胺能夠耗竭抑制性地調節T細胞，使用該藥能夠提高免疫反應。此外，其他一些化療藥物，如5-氟尿嘧啶、吉西他濱、紫杉類藥物能夠降低骨髓來源的抑制性細胞的數量。阿霉素是臨床上常用的化療藥物，有研究顯示阿霉素聯合抗PD-1和CTLA-4 抗體可以增強抗腫瘤效果[16]。目前已經開始進行免疫治療聯合化療或雙免疫治療聯合治療肺癌的臨床研究，初步結果顯示聯合組有更好的治療效果，高級別不良反應事件雖然增加，但可以控制，并且未出現治療相關死亡事件[17]。因此，化療聯合PD-L1抑制劑有可能存在協同抗腫瘤作用。腫瘤熱療是通過物理方法將組織加熱治療腫瘤，現已成為繼手術、放療、化療、免疫治療、靶向治療之后的又一類治療手段。腫瘤熱療是泛指用加熱來治療腫瘤的一類治療方法。在治療晚期肺癌患者時，熱化療聯合白細胞介素2可以很好地控制胸腔積液[18]。體外高頻熱療配合體內γ刀和化療聯合治療晚期肺癌顯示出了更好的療效[19]。聯合應用熱療與化療即熱化療，可以提高腫瘤區域的藥物濃度，同時降低正常組織的毒性作用，是為增效減毒。同時熱療可以使大量腫瘤抗原暴露，激活機體免疫功能，增強T細胞殺傷活性[20-21]。基于這些理論以及實踐基礎，本研究合理聯合3種治療手段，探究對膠質瘤細胞的殺傷效應，其聯合抗腫瘤的具體機制如下：①PD-L1抑制劑阻斷PD-1/PD-L1信號通路可以逆轉腫瘤免疫微環境，恢復T細胞的抗腫瘤活性，從而增強內源性抗腫瘤免疫效應；②化療是晚期腫瘤治療基石，可直接有效降低瘤負荷，通過腫瘤壞死暴露新抗原，還可以上調PD-L1，從而可以聯合PD-L1單抗的免疫治療；③熱療直接殺死腫瘤的同時也可暴露腫瘤抗原；④熱療可以使腫瘤局部升溫，增加化療藥物的局部富集。本研究結果顯示，與單一方法治療相比，三者聯合抑制腫瘤細胞增殖的能力最強。提示3種方法聯合治療膠質瘤可能成為神經膠質瘤新的聯合治療模式。

目前認為PD-L1高表達與使用PD-1/PD-L1患者的臨床獲益呈正相關。Berghoff等[22]對135例神經膠質瘤的標本檢測中發現，原發膠質瘤的PD-L1表達率達88%，繼發膠質瘤的PD-L1表達率達72%，膠質瘤的PD-L1表達率比其他腫瘤高。本研究對處理前后的腫瘤細胞PD-L1的表達進行檢測，結果顯示阿霉素可以提高PD-L1的表達，阿霉素聯合熱療更明顯提高PD-L1的表達。因此，阿霉素可能通過上調PD-L1的表達增敏PD-L1抗體抗腫瘤作用。

綜上所述，阿霉素化療聯合熱療、PD-L1抗體免疫治療可以協同抗腫瘤細胞增殖，為膠質瘤的治療提供新的思路。但本研究仍存在不足之處，如細胞株種類少、機制探究不夠深入。未來，尚需要大量的基礎研究和臨床研究對其效果加以證實。

[1] Ostrom QT,Gittleman H,Liao P,et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011[J]. Neuro Oncology,2014,16(Suppl):iv1-63.

[2] La-Beck NM,Jean GW,Huynh C,et al. Immune checkpoint inhibitors: new insights and current place in cancer therapy[J]. Pharmacotherapy,2015,35(10):963-976

[3] Pennock GK,Chow LQ. The evolving role of immune checkpoint inhibitors in cancer treatment[J]. Oncologist,2015,20(7):812-822.

[4] Turnis ME,Andrews LP,Vignali DA. Inhibitory receptors as targets for cancer immunotherapy[J]. Eur J Immunol,2015,45(7):1892-1905.

[5] Lee L,Gupta M,Sahasranaman S. Immune checkpoint inhibitors:an introduction to the next-generation cancer immunotherapy[J]. J Clin Pharmacol,2016,56(2):157-169.

[6] Sunshine J,Taube JM. PD-1/PD-L1 inhibitors[J]. Curr Opin Pharmacol,2015,23:32-38.

[7] Dong Y,Sun Q,Zhang X. PD-1 and its ligands are important immune checkpoints in cancer[J]. Oncotarget,2017,8(2):2171-2186.

[8] Topalian SL,Hodi FS,Brahmer JR,et al. Safety,activity,and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer[J]. N Engl J Med,2012,366(26):2443-2454.

[9] Brahmer JR,Tykodi SS,Chow LQ,et al. Safety and activity of anti-PD-L1 antibody in patients with advanced cancer[J]. N Engl J Med,2012,366(26):2455-2465.

[10] Hamid O,Robert C,Daud A,et al. Safety and tumor responses with lambrolizumab(anti-PD-1) in melanoma[J]. N Engl J Med,2013,369(2):134-144.

[11] Karwacz K,Bricogne C,MacDonald D,et al. PD-L1 co-stimulation contributes to ligand-induced T cell receptor down-modulation on CD8+T cells[J]. EMBO Mol Med,2011,3(10): 581-592.

[12] Gibson J. Anti-PD-L1 for metastatic triple-negative breast cancer[J]. Lancet Oncol,2015，16(6):e264.

[13] Cha E,Wallin J,Kowanetz M. PD-L1 inhibition with MPDL3280A for solid tumors[J]. Semin Oncol,2015，42(3):484-487.

[14] Salama AK,Moschos SJ. Next steps in immuno-oncology: enhancing antitumor effects through appropriate patient selection and rationally designed combination strategies[J]. Ann Oncol,2017,28(1):57-74.

[15] 魏潔，寇蓬，廉陽秧，等.阻斷PD-L1/PD-1途徑增強順鉑化療效果的實驗研究[J].實用醫學雜志，2016,32(1)：47-50.

[16] 王倩蓉，李寶生.D-1/PD-L1單抗聯合放療治療實體瘤研究進展[J].中華放射腫瘤學雜志，2016,25(12)：1375-1378.

[17] Rizvi NA,Hellmann MD,Brahmer JR,et al. Nivolumab in combination with platinum-based doublet chemotherapy for first-line treatment of advanced non-small-cell lung cancer[J]. J Clin Oncol,2016,34(25):2969-2679.

[18] 馬玉泉，劉搖暉，韓麗英，等.熱化療聯合白細胞介素2治療晚期肺癌惡性胸腔積液的療效觀察[J].河北醫科大學學報，2012，33(4)：447-449.

[19] 李雅軍，周正直，劉振忠，等.體內γ刀、體外高頻熱、化療聯合治療晚期肺癌36例療效觀察[J].河北醫科大學學報，2007，28(6):420-422.

[20] Tao Y,Ju E,Ren J,et al. Immunostimulatory oligonucleotides-loaded cationic graphene oxide with photothermally enhanced immunogenicity for photothermal/immune cancertherapy[J]. Biomaterials,2014,35(37):9963-9971.

[21] Guo L,Yan DD,Yang D,et al. Combinatorial photothermal and immuno cancer therapy using chitosan-coated hollow copper sulfide nanoparticles[J]. ACS Nano,2014,8(6):5670-5681.

[22] Berghoff AS,Kiesel B,Widhalm G,et al. Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma[J]. Neuro Oncology,2015,17(8):1064-1075.

(本文編輯：許卓文)

Effectsofadriamycincombinedwiththermotherapyandimmunotherapyongliomacells

ZHANGHai-feng1，ZHENGShi-ya2，OUYANGBin1,YANGDeng-yuan1,LIUWen-qing3，TIANJi-hui3*

(1.DepartmentofSurgery,NanjingCenterHospital,JiangsuProvince,Nanjing210000,China; 2.DpeartmentofOncology,MedicalSchoolofSoutheastUniversity，Nanjing210000,China; 3.DepartmentofNeurosurgery,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China)

ObjectiveTo observe the effect of adriamycin combined with thermotherapy and anti-programmed cell death ligand-1(PD-L1) antibodies on cell proliferation in U251 glioma cells, and to explore the expression of PD-L1 of U251 glioma cells after being treated with adriamycin and/or thermotherapy.MethodsIC50 of adriamycin for U251 cells was determined by CCK-8 assay. The U251 cells were divided into several groups according to different treatments, then the viability of cells were measured by CCK-8 assay. The expression of PD-L1 on the surface of U251 cells was determined by flow cytometry after treated with adriamycin and/or thermotherapy.ResultsAdriamycin combined with thermotherapy and anti-PD-L1 antibodies could inhibit glioma cells growth obviously compared with other groups. Adriamycin combined with thermotherapy could up-regulate the expression of PD-L1.ConclusionAdriamycin combined with thermotherapy and anti-PD-L1 antibodies is a promising treatment regime for glioma and our research provides theoretical basis for the combination of adriamycin, thermotherapy and immunotherapy in glioma treatment.

glioma;immunotherapy;thermotherapy；adriamycin

R730.264

A

1007-3205(2017)10-1144-04

2017-01-03；

2017-02-04

張海峰(1988-)，男，山東泰安人，江蘇省南京市中心醫院住院醫師，醫學碩士，從事膠質瘤診治研究。

*通訊作者。E-mail:nxtjh1968@163.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.10.007