高效液相色譜法定量分析菜籽油中的苯并芘

張海龍，張 維，舒 楠，胡婷婷，朱可霞，杜 靜，王信斌

（1.懷化學院生物與食品工程學院，民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湖南懷化 418008；2.國家糧食局武漢科學研究設計院有限公司，湖北武漢 430079）

高效液相色譜法定量分析菜籽油中的苯并芘

張海龍1，張 維1，舒 楠1，胡婷婷1，朱可霞1，*杜 靜1，王信斌2

（1.懷化學院生物與食品工程學院，民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湖南懷化 418008；2.國家糧食局武漢科學研究設計院有限公司，湖北武漢 430079）

建立菜籽油中苯并芘測定的高效液相色譜方法，采用ODS反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）作為分析柱，以甲醇為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫室溫，激發波長384 nm，發射波長406 nm，進樣量10 μL；樣品采用Cleanert BaP-3-SPE固相萃取柱處理。該方法加標回收率在87.00%～98.50%，具有準確、簡便、快速的特點。

高效液相色譜法；菜籽油；苯并芘

Abstract：In order to establish the determination method of benzopyrene in rape seed by high performance liquid chromatography，the C18 reverse-phase chromatographic column（ODS） （Φ4.6 mm×250 mm，5 μm） is used as analytical column.The detection conditions are that the flow rate of mobile phase（methanol）is 1.0 mL/min，the temperature is room temperature，excitation wavelength is set at 384 nm，the emission wavelength is 406 nm，the injection volume is 10 μL.The sample is treatment by solid-phase extraction column.The recovery rate of the method is between 87.00%and 98.50%.The method has the characteristics of accurate，simple，rapid.

Key words：high performance liquid chromatography；rapeseed oil；benzopyrene

苯并芘 （Benzo（a）Pyrene，B（a）P），又名 3,4- 苯并芘，是目前已知的20多種致癌多環芳烴中最具代表性的致癌物之一。多項研究表明，苯并芘可以誘導白血病、肺癌、肝癌和乳腺癌的發生，是一種很強的內分泌干擾物、致畸劑和致突變劑[1]，可通過呼吸道、消化道、皮膚等途徑被人體吸收，在人體中累積，長期食用損害人體健康，是世界公認的三大致癌物（亞硝胺、黃曲霉毒素和3,4-苯并芘） 之一[2]。由于苯并芘具有較強的親脂特性，可通過加工、運輸、貯藏等途徑進入油脂食品中[3-4]。食用油中苯并芘的形成機理研究尚未取得較大進展，還不清楚在食用油中產生的原因[5-6]。

國內外關于苯并芘的檢測方法主要是熒光分析法、高效液相色譜法、聯用技術、免疫學檢測法[7]等。食用油中苯并芘檢測主要采用高效液相色譜法，其分為樣品的預處理和檢測2個基本過程。由于食用油中苯并芘具有較強的親油性，含量少、穩定差、易吸附，且分析的樣品成分復雜，存在多種潛在干擾物質，如大量甘油三酯、脂肪物質，直接影響其測定[8]。目前，我國檢測植物油中苯并芘的國標（GB/T 22509—2008） 存在樣品處理復雜、耗時長、試劑耗費量大、對試劑和人員要求高等問題。所以，如何建立一種準確、簡便、快速、經濟檢測出食用油中的苯并芘含量方法，成為定量、定性分析工作的重點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜籽油，購于懷化市河西糧油市場；正己烷（分析純）、四氫呋喃（分析純）、乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純），均由天津市科密歐試劑有限公司提供；苯并芘萃取柱Cleanert BaP-3-SPE，天津博納艾杰爾科技有限公司提供；苯并芘標準品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供。

1.2 儀器與設備

LC-20A型島津高效液相色譜儀，日本島津公司產品；氮吹儀，上海皓莊儀器有限公司產品；Luna C18（2） 型（4.6 mm×250 mm，5 μm） 分析柱，美國pheno-menex公司產品。

2 試驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Luna C18（2） 型（4.6 mm×250 mm，5 μm） 帶保護柱；流速1.0 mL/min；柱溫25℃；流動相：甲醇；進樣量10 μL；激發波長384 nm，發射波長406 nm。

2.2 標準品溶液的配制

準確稱取10 mg苯并芘標準品用正己烷溶解定容于100 mL容量瓶中，配制成質量濃度為0.1 mg/mL的母液置于冰箱貯藏，取一定體積的母液用乙腈分別稀釋成 20.000，10.000，5.000，2.500，1.250，0.625 ng/mL的標準品溶液。

2.3 樣品處理

準確稱取0.500 0 g的菜籽油樣，用正己烷混勻定容至5 mL，漩渦混合1 min，加入到預先活化（先用5 mL二氯甲烷，再用5 mL正己烷活化柱子）的苯并芘萃取柱中，用8 mL正己烷洗脫柱子，棄去洗脫液；再用8 mL二氯甲烷洗脫并收集洗脫液于玻璃管中，用吹氮儀吹干，準確稱取1 mL甲醇漩渦混合1 min，過0.45 μm的濾膜，濾液供測試。

2.4 標準曲線的繪制

將配制好的苯并芘標準品溶液參照2.1中的色譜條件進樣，以峰面積為縱坐標、質量濃度為橫坐標，繪制標準品曲線。

2.5 準確度與精密度評價

加入適量的苯并芘標準品于油樣中，超聲混勻，按2.3樣品處理方法進行回收率和精密度測試，通過測定加標回收率對方法準確度進行評價，根據實驗結果的相對偏差對方法精密度與重現性進行評價。

3 結果與討論

3.1 標準品和樣品溶劑的選擇

考查對苯并芘有較大溶解度的正己烷、甲苯、乙酸乙酯有機溶劑，參照2.1中的色譜條件，分別進樣，發現甲苯、乙酸乙酯在出峰時間6.45 min左右時，具有較大響應值，峰面積較大，所以選擇正己烷作為溶解標準品苯并芘和樣品的溶劑。

甲苯液相色譜見圖1，乙酸乙酯液相色譜見圖2。

圖1 甲苯液相色譜

圖2 乙酸乙酯液相色譜

3.2 液相色譜條件的確定

試驗比較了甲醇-水體系作流動相時苯并芘的反相色譜行為，結果表明，甲醇體積分數為100%時，表現出更佳的穩定性和重現性，柱壓更低、安全性好。所以，試驗采用甲醇作流動相，苯并芘進行了等度洗脫分析。

苯并芘標準品液相色譜見圖3，樣品液相色譜見圖4。

圖3 苯并芘標準品液相色譜

圖4 樣品液相色譜

由圖4可以看出，在該洗脫條件下，苯并芘保留時間約為6.4 min，峰形對稱，柱效較高，既保證了定性定量的準確性，又同時兼顧了分析效率的要求。

3.3 定量標準曲線的統計結果

參照2.1中的色譜條件對系列不同質量濃度苯并芘標準品溶液進樣分析，分別以標準系列溶液的峰面積為縱坐標、標準系列溶液的質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，其線性回歸方程為Y=79 394X+18 244，相關系數R2=0.999，苯并芘的峰面積與質量濃度呈良好的線性關系，該方法的檢出限為0.625 ng/mL。

3.4 方法的準確度與精密度

稱取適量食用油，加入適量苯并芘標準品，參照2.3中的方法處理，進行回收率試驗，測得不同苯并芘標準品添加量的回收率和相對偏差。

方法的準確度與精密度評價見表1。

表1 方法的準確度與精密度評價

由表1可以看出，加標樣品回收率在87.00%～98.50%，平均回收率為95.21%；9次重復測定的相對偏差在6.78%～0.10%。由此可見，試驗確定測定菜籽油中苯并芘含量的高效液相色譜法具有較高的準確度和精確度。

4 結論

建立反相高效液相色譜法定量測定菜籽油中苯并芘含量的方法，采用ODS反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 作為分析柱；流速1.0 mL/min；柱溫室溫；激發波長384 nm，發射波長406 nm；以甲醇為流動相，樣品采用Cleanert BaP-3-SPE固相萃取。在該色譜分析條件下，苯并芘峰形對稱，保留時間合適，雜峰和苯并芘峰分離度高。該方法簡單、快速、高效，為食用油中苯并芘的定性、定量分析提供了一種重要途徑。

[1]Gelhaussl， Gilado， Hwanwt， et al．Multidrug resistance protein （MRP） 4 attenuates benzo[a]pyrene－mediated DNA－adduct formation in human bron-choalveolar H358 cells[J].Toxicol Lett，2012 （9）：58－66．

[2]徐文俊.致癌物質對食物的污染及預防 [J].成都大學學報（自然科學版），1999，18（2）：40－44.

[3]李進偉，王興國，金青哲．食用油中苯并（a） 芘的來源、檢測和控制 [J].中國油脂，2011，36（6）：7－11.

[4]段小麗，魏復盛.苯并（a）芘的環境污染、健康危害及研究熱點問題 [J].世界科技研究與發展，2002，24（1）：11－17.

[5]Cejpek K， Hajsova J， Kocourek V， et al．Changes in PAH levels during production of rapeseed oil[J].Food Addit Contam，1998，15（5）：563－574.

[6]劉國艷，張振芳，王興國，等.食用植物油中苯并 (a)芘來源及形成機理的研究進展 [J].中國油脂，2013，38 （4）：53－59.

[7]鄧安平.酶聯免疫吸附分析法測定苯并（a）芘和多氯聯苯 [J].環境化學，2006，25 （3）：340－343.

[8]石全英，劉香軍，杜雅榮.大豆油中苯并（a） 芘檢測方法的優化研究 [J].綠色科技，2015（6）：266-270.◇

Quantitative Determination of Benzopyrene in Rapeseed Oil by High Performance Liquid Chromatography

ZHANG Hailong1，ZHANG Wei1，SHU Nan1，HU Tingting1，ZHU Kexia1，*DU Jing1，WANG Xinbin2
（1.Key Laboratory of Hu'nan Province for Study and Utilization of Ethnic Medicinal Plant Resources，College of Biological and Food Engineering，Huaihua University，Huaihua，Hu'nan 418008，China；2.Wuhan Science Research&Design Institute，State Administration of Grain，Wuhan，Hubei 430079，China）

TS229

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.09.034

1671-9646（2017） 09b-0026-03

2017-07-23

2016年地方高校國家級大學生創新創業訓練計劃項目（201610548009）。

張海龍（1985— ），男，碩士，講師，研究方向為油料副產品加工與利用。

*通訊作者：杜 靜（1989— ），女，碩士，講師，研究方向為油作物副產物的應用。