辣椒渣鮮味肽初步分離純化研究

羅鳳蓮，王 燕，趙 靜

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，湖南長沙 410128；2.國家蔬菜加工技術研發(fā)分中心，湖南長沙 410128；3.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128）

辣椒渣鮮味肽初步分離純化研究

羅鳳蓮1，2，3，*王 燕1，2，3，趙 靜1

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，湖南長沙 410128；2.國家蔬菜加工技術研發(fā)分中心，湖南長沙 410128；3.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128）

以辣椒渣為原料，將辣椒渣中蛋白提取出來，采用風味酶和復合蛋白酶進行酶解得到蛋白酶解液，然后將辣椒渣酶解液進行初步分離純化和感官評價，獲得辣椒渣目標鮮味肽的相對分子質量范圍為307.32～1 422.69 Da，鮮味評分為8.0分，綜合風味評分為4.1分。

辣椒渣；鮮味肽；酶解；分離純化

Abstract：With chili residue as raw material，chili residue protein is extracted and later is hydrolyzed by protamex and flavorzyme.Then chili residue hydrolysates are isolated and purified and then sensory evaluated.The relative molecular mass of obtained chili residue umami peptide is range from 307.32～1 422.69 Da，with umami score 8.0 and comprehensive flavor score 4.1.

Key words：chili residue；umami peptide；enzymatic hydrolysis；isolation and purification

0 引言

辣椒渣（又名辣椒粕） 是紅辣椒深加工提取辣椒紅色素和辣椒素后剩余的渣料，辣椒渣得率為原料干辣椒的80%左右。辣椒渣含有極少量的紅色素、辣椒玉紅素、胡蘿卜素、玉米黃素、VC及辣椒堿類物質。另外，還含有蛋白質、脂肪、糖類、VB1，VB2及多種礦物質，其蛋白質含量可達14%～19%，并含有大量人體所必需的氨基酸和鮮味氨基酸[1-2]。

我國辣椒資源非常豐富，辣椒深加工企業(yè)有1 000余家，辣椒渣的產(chǎn)量也較高。辣椒渣具有殺菌、增加畜禽腸內(nèi)有益菌群、減少腸炎發(fā)病率、提高畜禽抗病能力等作用[3-6]。目前，辣椒渣主要用來作飼料或作為生產(chǎn)廢料被直接丟棄，造成了極大的資源浪費。

由于辣椒渣中蛋白質含量豐富，是非常寶貴的食品資源。因此，試驗以辣椒渣為原料，將辣椒渣蛋白提取出來，進行酶解處理，以具有鮮味的辣椒肽為考查目標，參照預試驗確定的最佳酶解工藝條件，采用風味酶和復合蛋白酶進行雙向酶解，制得富含鮮味肽的蛋白酶解產(chǎn)物。利用超濾、凝膠過濾層析等現(xiàn)代分離純化手段對辣椒渣蛋白酶解產(chǎn)物初步分離純化，然后采用感官評價法對目標辣椒渣鮮味肽的鮮味、風味進行評價。此研究將為辣椒渣蛋白的利用提供理論依據(jù)，使辣椒渣變廢為寶，大大地提高辣椒渣的附加值，而且還可以增加鮮味劑的來源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

風味酶（200 U/mg）、復合蛋白酶（120 U/mg），上海楷洋生物科技有限公司提供；辣椒渣分離蛋白，蛋白質含量59.14%，實驗室自制；葡聚糖凝膠Sephadex G-15型樹脂，北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司提供；D45 mm透析袋（截留分子質量8 000～14 000 U），北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司提供；桿菌肽（Mr=1 422.69 Da）、還原型谷胱甘肽GSH（Mr=307.32 Da）、二甘氨酰甘氨酸Gly-Gly-Gly（Mr=189.17 Da），美國Amresco公司提供。

氫氧化鈉、甲基紅、溴甲酚綠、鹽酸、硼砂、甲醛、無水硫酸鉀、硫酸銅、濃硫酸、硼酸、單寧、檸檬酸等均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司提供。

1.2 儀器與設備

FW177型中草藥粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；AUY220型分析天平，日本島津公司產(chǎn)品；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海飛越實驗儀器有限公司產(chǎn)品；KDN-103F型定氮儀，上海纖檢儀器有限公司產(chǎn)品；TDZ5型臺式低速離心機，湖南赫西裝備儀器有限公司產(chǎn)品；GL-3250B型磁力攪拌器，江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；FD-1B型冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司產(chǎn)品；HD-3型紫外檢測器、DHLA型恒流泵、層析柱（0.8 cm×80 cm）、HD-A型電腦采集器，上海滬西分析儀器廠產(chǎn)品；PHS-3C型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司產(chǎn)品；Ultra-15型離心超濾管，上海北諾生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

在G20杭州峰會開幕主旨演講中，習總書記是這樣介紹杭州的：“杭州是中國的一個歷史文化重鎮(zhèn)和商貿(mào)中心，有千年以上的歷史。千百年來，從白居易到蘇東坡，從西湖到大運河，杭州的悠久歷史和文化傳說引人入勝。杭州是創(chuàng)新活力之城，電子商務蓬勃發(fā)展，在杭州點擊鼠標，聯(lián)通的是整個世界。杭州也是生態(tài)文明之都，山明水秀，晴好雨奇，浸透著江南韻味，凝結著世代匠心。”

1.3.1 辣椒渣分離蛋白的提取及蛋白酶解液的制備

辣椒渣→粉碎，過100目過篩→采用超聲輔助堿溶法提取（選擇超聲功率250 W，超聲溫度50℃，超聲時間4 h，NaOH堿液濃度0.3 mol/L，料液比1∶20） →離心（以轉速3 000 r/min離心15 min） →收集上清液→稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值3.6→離心（以轉速3 000 r/min離心15 min） →收集沉淀，經(jīng)透析袋脫鹽→冷凍干燥（溫度-50℃，時間10 h），即為辣椒渣分離蛋白[2，7]。

將辣椒渣分離蛋白和水按照1∶10的比例混合均勻，在風味酶和復合蛋白酶質量比為1∶2，總酶用量為2%（以辣椒渣分離蛋白的質量計算），選擇預試驗確定的最佳條件（酶解時間6 h，pH值6.5，酶解溫度50℃）進行酶解，獲得辣椒渣蛋白酶解液。

1.3.2 辣椒渣蛋白酶解液的超濾分離

采用離心超濾管對辣椒渣蛋白酶解液進行超濾分離。超濾膜的可截留分子量一般包括1，3，5，10 kDa等不同大小的分子量。一般來說，食源性蛋白中的呈味肽，其分子量均小于5 kDa[8-9]。預試驗結果也表明辣椒肽分子量較小，故選用3 kDa的超濾膜進行分離。首先，將酶解液通過0.45 μm的微孔濾膜，然后使用離心超濾管（截留分子量為3 kDa）對酶解液進行超濾，收集好大于3 kDa和小于3 kDa兩部分濾液，冷藏備用。

1.3.3 辣椒渣蛋白酶解液的凝膠過濾層析分離[10-11]

經(jīng)過預試驗，選擇葡聚糖凝膠SephadexG-15為最終填充柱材料。稱取5 g葡聚糖凝膠SephadexG-15，加200 mL蒸餾水，于室溫下溶脹6 h，達到溶脹平衡后將懸浮在液體表面的小顆粒傾瀉倒出，靜置過夜，棄去多余的蒸餾水，使葡萄糖凝膠質量分數(shù)為50%～70%。然后，參照文獻的方法進行操作，得到凝膠過濾層析液。

1.3.4 辣椒渣鮮味肽的分子量估測

采用還原型谷胱甘肽GSH（307.32 Da）、桿菌肽（1 422.69 Da）、二甘氨酰甘氨酸（189.17 Da） 為標準品，分別配制質量濃度為10 mg/mL的肽標準溶液。準確移取1 mL肽標液使通過葡聚糖凝膠SephadexG-15層析柱，再進行洗脫，采用紫外檢測器和電腦采集器繪制圖譜。將標準品的洗脫出峰時間與樣品的洗脫出峰時間進行對比，初步估計辣椒渣鮮味肽的相對分子質量范圍。

1.3.5 辣椒渣鮮味肽的感官評價方法

選擇檸檬酸（代表酸味）、蔗糖（代表甜味）、鹽酸奎寧（代表苦味）、谷氨酸鈉（代表鮮味）、氯化鈉（代表咸味）做感官評價呈味基準物質，按照呈味閾值濃度（檸檬酸0.001 2%，白砂糖0.5%，鹽酸奎寧0.000 05%，谷氨酸鈉0.15%，氯化鈉0.08%）[12]、2倍呈味閾值濃度、4倍呈味閾值濃度、6倍呈味閾值濃度配制標準使用液，依次代表起始味道（Threshold）、輕微（Slight）味道、一般（Modetate）味道、較強（Strong）味道，然后對辣椒渣酶解液進行感官評價。挑選7名對味道很敏感的評價員（4男3女），反復訓練使記住基準物質味道，再根據(jù)基準物質味道對試驗樣品的味道分別進行評判，并在呈味強度標尺相應的位置標記酸、甜、苦、鮮、咸的程度，5種味道評分取值范圍設定在0～15分，最后對所得數(shù)據(jù)采用加權法計算總分。

呈味強度標尺（起始、輕微、一般、較強） 見圖1，感官評價綜合評分權重系數(shù)見表1。

圖1 呈味強度標尺（起始、輕微、一般、較強）

表1 感官評價綜合評分權重系數(shù)

2 結果與分析

2.1 酶解液的超濾分離

辣椒渣蛋白經(jīng)過風味酶和復合蛋白酶的雙酶水解之后，獲得辣椒渣蛋白酶解液，再經(jīng)過超濾分離后得到分子量小于3 kDa和分子量大于3 kDa的2種組分，進行感官評價。測得經(jīng)超濾分離截留分子量小于3 kDa的組分鮮味更加明顯，綜合風味也更好。因此，選擇截留分子量小于3 kDa的組分進一步進行分離純化。

超濾分離后2種組分的感官評價結果見表2。

表2 超濾分離后2種組分的感官評價結果/分

2.2 辣椒渣蛋白酶解液的凝膠過濾層析分離純化

對超濾后分子量小于3 kDa的組分Ⅰ繼續(xù)進行凝膠過濾分離純化，選用凝膠SephadexG-15，進樣量1 mL，上樣濃度25 mg/mL，以蒸餾水為洗脫液，洗脫速度30 mL/h，得到3個洗脫峰A，B，C，以感官評分進行結果評定。

辣椒渣蛋白酶解液的凝膠過濾層析見圖2，凝膠過濾層析后不同組分的感官評價結果見表3。

圖2 辣椒渣蛋白酶解液的凝膠過濾層析

表3 凝膠過濾層析后不同組分的感官評價結果/分

測得A組分的鮮味評分為5.0分，綜合風味評分為2.0分；B組分的鮮味評分為8.0分，綜合風味評分為4.1分；C組分的鮮味評分為6.0分，綜合風味評分為2.9分。因此，選擇B組分為目標鮮味肽。

2.3 辣椒渣鮮味肽分子量的估測

辣椒渣鮮味肽B組分與還原型谷胱甘肽GSH（307.32 Da）、桿菌肽（1 422.69 Da）、二甘氨酰甘氨酸（189.17 Da） 標樣在相同凝膠過濾層析條件下比較，依據(jù)其出峰時間可以初步判定，辣椒渣鮮味肽B組分的相對分子質量范圍為307.32～1 422.69 Da。

3 結論

試驗選擇復合蛋白酶和風味酶酶解辣椒渣蛋白，采用超濾法對辣椒渣蛋白酶解液進行第一步分離提純，感官評價結果表明分子量小于3 kDa的組分鮮味更加明顯，綜合風味也更好。采用凝膠過濾層析法作進一步分離純化，最終得到較純的辣椒渣鮮味肽ⅠB組分，其相對分子質量范圍為307.32～1 422.69 Da，鮮味評分為8.0分，綜合風味評分為4.1分。

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[12]夏延斌，王燕.食品化學 [M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2015：25-28.◇

Preliminary Isolation and Purification of Chili Residue Umami Peptide

LUO Fenglian1，2，3，*WANG Yan1，2，3，ZHAO Jing1
（1.College of Food Science and Technology，Hu'nan Agricultural University，Changsha，Hu'nan 410128，China；2.National R＆D Center for Vegetable Processing，Changsha，Hu'nan 410128，China；3.Hu'nan Provincial KeyLaboratoryofFood Science and Biotechnology，Changsha，Hu'nan 410128，China）

TS201.2

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.09.028

1671-9646（2017） 09b-0008-03

2017-07-06

湖南省科技重大專項子項目“蔬菜貯藏保鮮和加工新技術以及功能成分高效綜合利用研究與示范”（2015NK1003）。

羅鳳蓮（1973— ），女，博士，副教授，研究方向為食品分析與營養(yǎng)。

*通訊作者：王 燕（1968— ），女，博士，教授，研究方向為食品功能成分和食品添加劑。