響應面法優化酶促水解藍圓鲹蛋白制備抗凝血肽的研究*

周浩純 顧晗可 單丹婷 宋璐瑤 俞舜杰 黃光榮*

（中國計量大學生命科學學院，浙江杭州 310018）

·基礎研究·

響應面法優化酶促水解藍圓鲹蛋白制備抗凝血肽的研究*

周浩純**顧晗可 單丹婷 宋璐瑤 俞舜杰 黃光榮***

（中國計量大學生命科學學院，浙江杭州 310018）

以藍圓鲹加工副產物為原料，探究酶促水解制備抗凝血肽的工藝條件。研究結果表明，堿性蛋白酶對藍圓鲹蛋白質的水解效果最好，經單因素試驗和響應面試驗優化后得到堿性蛋白酶酶促水解的最佳條件為：水解pH 7.5，水解溫度44℃，堿性蛋白酶添加量9 500 U/g，水解時間4.2 h，響應面模型預測水解液的相對抗凝血活性值為100 AT-U/mL，3次驗證試驗表明，實際相對抗凝血活性為101 AT-U/mL，水解度為19.55%，與預測值接近。

藍圓鲹；抗凝血肽；酶促水解；加工副產物；響應面法

藍圓鲹（Decapterus maruadsi）屬于大宗低值魚，主要分布在我國南海，數量較多，是典型的海洋經濟魚類之一。藍圓鲹除鮮食外，主要用于加工制作魚罐頭、魚糜等產品，加工后的副產物富含蛋白質，不易貯藏與運輸，通常用作制備飼料，經濟價值較低。由于藍圓鲹加工副產物富含蛋白質，是制備各種生物活性肽的優良原料，如制備抗氧化肽、降血壓肽、礦物元素結合肽。目前，利用藍圓鲹加工副產物制備抗凝血肽的研究尚未見報道。凝血是機體重要的生理防御過程，但在病理條件下可誘發血栓，繼而導致如肺梗塞、腦血栓、視網膜動靜脈阻塞、心肌梗塞和四肢及周圍血管栓塞等疾病，嚴重危害人類生命健康。目前市面上常見的抗血栓藥主要是化學合成西藥，也有酶制劑，如瑞替普酶等。近年來的研究表明，一些蛋白質水解得到的生物活性肽也具有抗凝血作用，來源包括黃鰭金槍魚蛋白、蛋清粉、蝎子蛋白、蝦虎魚蛋白、紫貽貝蛋白、菲牛蛭蛋白。經研究發現，藍圓鲹加工副產物的酶促水解液具有抗凝血作用，本文主要利用響應面法優化酶促水解藍圓鲹加工副產物制備抗凝血肽的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

藍圓鲹加工副產物，浙江省溫州洞頭區水產品市場。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預處理

藍圓鲹加工副產物→烘干→去頭→粉碎過篩→異丙醇脫脂2～3次→揮發有機試劑→烘干→粉碎過篩→低溫密封保存

1.2.2 酶促水解

稱取脫脂后的魚粉于錐形瓶中，加入一定pH的磷酸緩沖液200 mL（胃蛋白酶用KCl緩沖液），搖勻后加入一定量的蛋白酶，在恒溫水浴搖床（150 r/min）中水解一定時間后沸水浴滅酶10 min，待冷卻后離心（10 000 r/min，4℃，10 min），取上清液，保存備用。

1.2.3 蛋白酶的篩選

選用復合蛋白酶（溫度50℃、pH7.5）、堿性蛋白酶（溫度50℃、pH8.5）、風味蛋白酶（溫度50℃、pH7.0）、胰蛋白酶（溫度37℃、pH8.0） 分別對脫脂后的魚粉進行酶促水解，以抗凝血活性、水解度作為指標，篩選出最適的蛋白酶。

1.2.4 酶促水解條件優化

單因素試驗：分別以水解溫度（25℃～65℃）、pH值（7.0～9.5）、蛋白酶添加量（8 000 U/g～13 000 U/g，以每g蛋白質所需要的酶添加單位表示）、水解時間（1 h～5 h） 和魚粉添加量（2 g/L～150 g/L） 為單因素進行水解，測定水解液的水解度和相對抗凝血活性。

響應面優化：根據單因素試驗結果，選擇pH、水解溫度、酶添加量、水解時間4個因素進一步優化，以單因素試驗中的較佳水平為中心點，運用CCD（Central Composite Design） 進行響應面試驗設計，測定各試驗組的水解液相對抗凝血活性，四因素三水平響應面試驗設計的因素水平編碼值如表1所示。

表1 響應面試驗因素水平編碼表

1.3 測定方法

1.3.1 蛋白質含量的測定

藍圓鲹魚粉樣品經2.0 mol/L NaOH在80℃條件下回流水解4 h后，以6.0 mol/L HCl調節pH至中性，以福林酚法測定總蛋白質含量。

1.3.2 水解度的測定

根據參考文獻［19］中方法測定可溶性肽含量。水解度（DH）用公式計算：水解度=（可溶性肽的含量/總蛋白的含量）×100%。

1.3.4 相對抗凝血活性的測定

根據參考文獻［17］中方法測定抗凝血活性，以相對值表示。

1.4 數據分析

重復3次試驗，最終結果顯示為平均值±標準差，統計圖在Origin 8.5軟件下完成。響應面分析在Design Expert 8.0軟件下完成。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

以常見的4種商業化蛋白酶對脫脂后的藍圓鲹加工副產物進行酶促水解，測定其水解度和抗凝血活性，結果如下頁圖1所示。從圖1可以看出，堿性蛋白酶具有更高水解效率，其水解度最高，其次是復合蛋白酶；堿性蛋白酶和胰蛋白酶水解液具有同等的抗凝血活性，結合水解度，最后選擇堿性蛋白酶為水解酶，研究其最佳水解條件。

2.2 單因素試驗

圖1 不同蛋白酶水解液的水解度和抗凝血活性的影響

試驗研究了魚粉添加量、堿性蛋白酶添加量、水解溫度、pH和水解時間對藍圓鲹蛋白質酶促水解過程的影響，測定水解液的抗凝血活性和水解度，結果如圖2～6所示。由圖2可知，魚粉添加量與水解液抗凝血活性沒有明顯規律，當魚粉添加量在5 g/L和20 g/L時抗凝血活性明顯高于其他水平，而水解度隨著魚粉的增加而降低。由圖3可知，水解度隨堿性蛋白酶添加酶量先增加，然后趨于平衡，而抗凝血活性則在酶添加量為9 000 U/g時最高。由圖4可知，水解度在水解時間為40℃時最高，但水解液的抗凝血活性在40℃和50℃時均表現出相對較強。由圖5可知，水解度在pH8.5及以后表現出較高值，這是堿性蛋白酶的特點，但水解液的抗凝血活性卻并未出現有規律的變化，在pH7.0和pH8.0時表現出較大相對抗凝血活性。從圖6可知，水解時間越長，抗凝血活性越高，但在4 h后有明顯下降，水解度也隨著水解時間增加而增加，但在3 h后逐漸減小。因此，通過單因素試驗確定下一步響應面優化水解條件的因素為堿性蛋白酶添加量、水解溫度、水解時間和pH，其中心點分別為9 000 U/g、40℃、4 h、和8.0。

圖2 魚粉添加量對藍圓鲹蛋白質水解的影響

圖3 酶添加量對藍圓鲹蛋白質水解的影響

圖4 水解溫度對藍圓鲹蛋白質水解的影響

圖5 pH對藍圓鲹蛋白質水解的影響

2.3 響應面優化堿性蛋白酶水解條件

圖6 水解時間對藍圓鲹蛋白質水解的影響

表2 響應面試驗結果

以響應面CCD設計，試驗了堿性蛋白酶添加量、水解溫度、水解時間和pH對水解液抗凝血活性的影響，共29個試驗，其中中心點5個，按表2順序進行試驗，測定水解液的抗凝血活性，結果如表2所示。利用Design Expert 8.0軟件，以抗凝血活性為響應值，酶添加量、水解溫度、水解時間和pH為變量，進行二次回歸模型分析，得到預測模型公式為：

抗凝血活性=+563.365 23-128.808 89X1+2.321 81X2-0.024 253X3+12.166 67X4-0.355 56X1X2-3.780 09E-017X1X3-2.000 00X1X4+1.15266E-018X2X3-0.333 33X2X4+1.000 00E-003X3X4+9.813 33X12+0.030 288X22+8.533 33E-007X32+2.583 33X42，其中X1為pH，X2為水解溫度（℃），X3為酶添加量（U/g），X4為水解時間 （h）。

對影響水解過程的4個因素進行方差分析，結果如表3所示。

表3 響應面試驗結果的方差分析

由表3可知，4個因素的顯著性影響大小依次為：水解溫度＞pH＞水解時間＞酶添加量。其中水解溫度這一因素表現為極顯著，因此可看出溫度對于水解液抗凝血活性的影響非常大；該模型中只有酶添加量這一個因素為不顯著，分析原因可能是所加的酶量均達到或接近飽和。用Design Expert8.0軟件預測得到的最優水解條件為：堿性蛋白酶添加量9 500 U/g，水解溫度44℃，水解時間4.2 h和水解pH7.5，在此條件下進行驗證試驗，測得該條件下藍圓鲹水解液的相對抗凝血活性達100 AT-U/mL，與預測值101 AT-U/mL非常接近。此時，水解液的水解度為19.55%。

3 結論

藍圓鲹是我國南海經濟魚類之一，加工后的副產物含有大量的蛋白質，是一種較好的蛋白質資源。本文以藍圓鲹加工后的副產物為原料，脫脂后經過酶促水解，制備成具有抗凝血作用的水解液。結果表明，堿性蛋白酶對藍圓鲹蛋白質的水解效果最好，經單因素和響應面試驗優化的水解條件為：水解pH 7.5，水解溫度44℃，堿性蛋白酶添加量9 500 U/g，水解時間4.2 h，在此條件下進行水解，相對抗凝血活性可達到100 AT-U/mL，水解度可達19.55%。

［1］蔣日進，徐漢祥，金海衛，等.東海藍圓鲹的攝食習性［J］.水產學報，2012，36（2）:216-227.

［2］劉光明，李曉燕，胡家偉，等.一種藍圓鲹罐頭的加工方法：中國，CN201510223447.X［P］.2015-08-26.

［3］張浩.藍圓鲹冷凍魚糜加工關鍵工藝研究［D］.福州:福建農林大學，2014.

［4］蔣海萍.藍圓鲹蛋白制備抗氧化肽的研究［D］.南寧:廣西大學，2014.

［5］何婷.藍圓鲹蛋白控制酶解及酶解物抗氧化特性研究［D］.廣州:華南理工大學，2008.

［6］楊燊，郝更新，陳申如，等.藍圓鲹酶解條件的響應面法優化及其產物抗氧化活性的研究［J］.中國食品學報，2012，12（8）:32-40.

［7］JIANG H P，TONG T Z，SUN J H，et al.Purification and characterization of antioxidative peptides from round scad（Decapterus maruadsi） muscle protein hydrolysate ［J］.Food Chemistry，2014，154（2）:158-163.

［8］舒冰.酶解藍圓鲹蛋白制備降血壓肽的研究［D］.南寧:廣西大學，2012.

［9］ ZHANG W T，LI Y N，ZHANG J，et al.Optimization of Hydrolysis Conditions for the Production of Iron-Binding Peptides from Scad （Decapterus maruadsi） Processing Byproducts ［J］.American Journal of Biochemistry and Biotechnology，2016，12（4）:220-229.

［10］SCHWIENHORST A.Direct thrombin inhibitors:a survey of recent developments ［J］.Cellular and Molecular Life Sciences，2006，9（63）:150-160.

［11］AGHAABDOLLAHIAN S，RABBANI M，GHAEDI K，et al.Molecular cloning of Reteplase and its expression in E.coliusing tacpromoter ［J］.Advanced Biomedical Research，2014，3:190-190.

［12］NIRANJAN R，JUNG W K，ERESHA M，et al.A Novel AnticoagulantPurified from Fish Protein Hydrolysate Inhibits Factor Ⅶ and Platelet Aggregation ［J］.Life Science，2005，76（22）:2 607-2 619.

［13］劉靜波，王菲，王翠娜，等.Alcalase酶解蛋清粉制備抗凝血肽的工藝優化［J］.吉林大學學報（工學版），2012，42（1）:250-255.

［14］REN Y，WU H，LAI F R，et al.Isolation and identification of a novel anticoagulant peptide from enzymatic hydrolysates of scorpion （Buthus martensii Karsch）protein ［J］.Food Research International，2014，64:931-938.

［15］NASRI R，AMOR I B，BOUGATEF A，et al.Anticoagulant activities of goby muscle protein hydrolysates ［J］.Food Chemistry，2012，133（3）:835-841.

［16］JUNG W K，KIM S K.Isolation and characterization of an anticoagulant oligopeptide from blue mussel，Mytilus edulis［J］.Food Chemistry，2009，117（4）:687-692.

［17］鐘超.菲牛蛭抗凝血肽的酶法制備及其活性研究［D］.廣州:華南理工大學，2012.

［18］PARK K A，CHOI Y M，KANG S，et al.Effects of Proteins on the Reactivity of Various Phenolic Compounds with the Folin-Ciocalt Reagent［J］.Korean Journal of Food Science&Technology，2015，47（3）:299-305.

［19］ADLER-NISSEN J.Determination of the degree of hydrolysis of food protein hydrolysates by trinitrobenzenesulfonic acid ［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1979，27（6）:1 256-1 262.

Optimization ofenzymatic hydrolysis of Decapterus maruadsi protein for anticoagulant peptides production by response surface methodology*

ZHOUHaochun**GUHankeSHANDantingSONGLuyaoYUShunjieHUANGGuangrong***
（College oflife sciences，China jilianguniversity，ZhejiangHangzhou 310018，China）

The anticoagulant peptides fromblue scad(Decapterus maruadsi)processingby-products byenzymatic hydrolysis were investigated in this paper.The results showed that alcalase was the best choice for producinganticoagulant peptides fromblue scad processingby-products.The best hydrolysis conditions were optimized bysingle-factor-experiment and response surface methodology(RSM)as following:hydrolysis pH 7.5,hydrolysis temperature of44℃,alcalase addition of 9 500 U/g and hydrolysis time of 4.2 h.The relative anticoagulant activity by the RSMprediction model was 100 AT-U/mL,which was veryclose tothat ofthree verification experiments,101 AT-U/mL,and the degree ofhydrolysis was 19.55%at the best hydrolysis conditions.

Decapterus maruadsi；anticoagulant peptides；enzymatic hydrolysis；processing by-products；response surface methodology

TS254.4

A

1673-6044（2017）03-0052-05

10.3969/j.issn.1673-6044.2017.03.016

國家大學生創新創業訓練計劃項目（201610356004）

**周浩純，女，1996年出生，中國計量大學食品質量與安全專業在讀本科。

*** 黃光榮，通訊作者，E-mail：grhuang@126.com.

2017-04-18