丁基膠塞細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法研究

張偉+陳瑞超+蘆錦

摘 要： 丁基膠塞作為常用藥品包材，無論是生產(chǎn)還是使用階段均會與藥品產(chǎn)生直接接觸，為保證其質(zhì)量達(dá)標(biāo)，必須要對其進(jìn)行熱源檢查。而在實際檢查中，為避免熱源法敏感度對最終檢查結(jié)果準(zhǔn)確性的影響，多選擇應(yīng)用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法處理，具有更高的靈敏性。本文主要以丁基膠塞作為對象，對其細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法要點與控制措施進(jìn)行了簡單分析。

關(guān)鍵詞： 丁基膠塞；細(xì)菌；內(nèi)毒素檢查

丁基膠塞具有較強(qiáng)的化學(xué)穩(wěn)定性、氣密性、潔凈性以及生物性，是比較常見的藥品包材，但是因為配方復(fù)雜性以及原材料所選不同，會存在部分活性較強(qiáng)的分在封裝后與藥品產(chǎn)生反應(yīng)，出現(xiàn)膠塞與藥物之間的相容性問題。為確保所用丁基膠塞質(zhì)量達(dá)標(biāo)，需要對其進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，確認(rèn)是否存在細(xì)菌內(nèi)毒素污染情況，保證藥品、器械的安全性。

一、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法原理

細(xì)菌內(nèi)毒素為與革蘭陰性菌細(xì)胞壁相關(guān)的一種熱原物質(zhì)，也是目前發(fā)現(xiàn)普遍處于水溶液容重的熱原，可以作為藥品安全性檢查的重要指標(biāo)。細(xì)菌內(nèi)毒素多由革蘭陰性菌產(chǎn)生，為細(xì)胞壁最外層部分脂多糖，同時含有親水多糖鏈與輸水脂肪酸鏈，使其在水溶液內(nèi)具有自然聚集成團(tuán)特點。表現(xiàn)在機(jī)體上，如致死毒性、發(fā)熱性、體重減輕、白細(xì)胞減少等；表現(xiàn)在細(xì)胞水平上，如阻止巨噬細(xì)胞游走以前列腺抗腫瘤壞死等。基于其特性，可以通過細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法確認(rèn)藥品質(zhì)量是否達(dá)標(biāo)，對比傳統(tǒng)家兔熱原檢測方法，此種檢查方法具有更大應(yīng)用優(yōu)勢，檢查結(jié)果也更為精確[1]。檢查時主要是利用鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝聚反應(yīng)機(jī)制，確認(rèn)試驗品細(xì)菌內(nèi)毒素限量是否合理，主要包括凝膠法與光度測定法兩種，且光度測定法又可分為濁度法與顯色基質(zhì)法，現(xiàn)在在實際應(yīng)用中標(biāo)準(zhǔn)化程度不斷提高。

二、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查影響因素

在應(yīng)用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法時，需要保證試驗過程的無菌性，全程采取無菌操作，避免微生物對供試品產(chǎn)生影響，而降低檢查結(jié)果準(zhǔn)確性。因此，在試驗前需要對實驗室進(jìn)行全面清潔，并利用紫外燈持續(xù)滅菌1h，然后在百級凈化臺上實驗操作，盡量減小動作幅度，最大程度上來避免試管的振動。另外，還要提前準(zhǔn)備好實驗所需的各項器皿，并全面清潔消毒，確保不存在外源性內(nèi)毒素，一般可將其置于250℃條件下持續(xù)干烤60min[2]。以凝膠法實驗過程為例，要求細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水內(nèi)毒素含量在0.015ml～1之間。部分供試品還要進(jìn)行復(fù)溶、稀釋處理，或者是在水性溶液內(nèi)浸提制成供試品溶液，并控制溶液pH在6.0～8.0之間，確保可以正常凝聚。就以往經(jīng)驗來看，溶液pH值過高或過低均會對部分內(nèi)毒素產(chǎn)生損壞，降低鱟試劑與內(nèi)毒素發(fā)生的聚集效果。而對于自身酸堿性較大，或者具有緩沖能力的供試品，需要提前對被測溶液pH進(jìn)行調(diào)整，將其控制在技術(shù)要求范圍內(nèi)。其中，在對溶液進(jìn)行稀釋時，可以利用漩渦混合器，促使溶液均勻混合，盡量避免出現(xiàn)假陽性或者假陰性結(jié)果，提高檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性與代表性。

三、丁基膠塞細(xì)菌內(nèi)毒素檢查實驗

1.實驗準(zhǔn)備

1.1儀器

電熱恒溫水浴箱與渦輪混合器，數(shù)量若干的玻璃器皿，且要對所有玻璃用具進(jìn)行250℃條件下的1h干熱滅菌，以免存在外源性內(nèi)毒素。

1.2試劑

靈敏度為0.5EU/mL的鱟試劑，為保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，可以分別選擇同靈敏度的多種批號試劑。還需要提前準(zhǔn)備好效價為150EU/支的細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水以及注射用鹵化丁基膠塞[3]。

2.實驗方法

2.1 靈敏度復(fù)核

以《中國藥典》相關(guān)規(guī)定與資料作為依據(jù)，對鱟試劑進(jìn)行靈敏度復(fù)核，可得三種不同批號的鱟試劑靈敏度均符合要求。

2.2制備浸提液

在制備浸提液時，需要保證全程無菌操作，排除微生物對試驗結(jié)果的影響。選取3支相同批號的注射用鹵化丁基膠塞，然后用純化水將其沖洗干凈，用濾紙吸收剩余水分，放置到250mL的廣口瓶內(nèi)并加塞處理，最后將廣口瓶放入壓力蒸汽滅菌器內(nèi)，保持115℃條件持續(xù)滅菌30min。滅菌結(jié)束后按照表面積加入50mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，確保能夠?qū)⒛z塞全部浸沒，重新將廣口瓶加塞密封，后放置于37±1℃恒溫水浴內(nèi)保溫72±2h。其中，在保溫階段還需要進(jìn)行數(shù)次振蕩處理，避免產(chǎn)生微生物。保溫時間結(jié)束后取出冷卻，作為注射用鹵化丁基膠塞的浸提液。

2.3預(yù)干擾試驗

按照樣品表面積：水為1：0.5比例選取注射用鹵化丁基膠塞浸提液，并用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋，獲得1：0.5、1：1、1：2、1：3、1：4功5種濃度的溶液。利用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水來對細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行稀釋，得到0.25λ、0.5λ、λ、2λ共4種濃度溶液[4]。然后利用細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品配置不同濃度的樣品陽性液，按照專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行預(yù)干擾試驗。

2.4供試品干擾試驗

根據(jù)《中國藥典》內(nèi)容進(jìn)行供試品預(yù)干擾試驗，即選擇細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水與注射用鹵化丁基膠塞浸提液，加入到同支細(xì)菌內(nèi)毒素溶液內(nèi)，且每一個濃度均需要做4管平行試驗。然后選擇細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品0.25λ、0.5λ、λ、2λ的細(xì)菌內(nèi)毒素溶液，同樣每一濃度做4管平行試驗。另外，對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水以及注射用鹵化丁基膠塞浸提液做2管陰性對照試驗。最大濃度2.0λ均設(shè)定為陽性，最低濃度0.25λ則均為陰性，按照工程En=lg（∑X/4）計算，分別確定細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水與注射用鹵化丁基膠塞浸提液所制細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點幾何平均值En與Et，其中X表示細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水或者注射用鹵化丁基膠塞浸提液制成的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)終點濃度對數(shù)值。當(dāng)En處于0.5λ～2.0λ時，Et在0.5En～2.0En時，確認(rèn)注射用鹵化丁基膠塞浸提液不干擾試驗。

3.結(jié)論分析

經(jīng)過試驗后可以確定，0.5EU/支的鱟試劑作為干擾試劑時，Et值在0.5En～2.0En范圍內(nèi)，即注射用鹵化丁基膠塞浸提液不會對細(xì)菌內(nèi)毒素試驗產(chǎn)生干擾，確定細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法對丁基膠塞的熱原檢查可行。

結(jié)束語：

應(yīng)用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法來確定丁基膠塞質(zhì)量是否達(dá)標(biāo)，對比以往檢查方法其具有更大的優(yōu)勢，但是整個過程要做好細(xì)節(jié)管理，消除各類因素的影響，保證檢查結(jié)果的可靠性。■

參考文獻(xiàn)

[1] 裴宇盛，蔡彤，高華.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查新方法進(jìn)展[J].藥物分析雜志，2014，（03）：392-395.

[2] 肖貴南，孫清萍，盛英美.如何建立新藥的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，（32）：159-160+162.

[3] 張義偉.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的幾點體會[J].中國實用醫(yī)藥，2010，（03）：86-87.

[4] 張之奎，梁風(fēng)芹，辛國忠，于文勝，鄭勇強(qiáng).注射用鹵化丁基橡膠塞的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[J].中國藥業(yè)，2007，（02）：41-42.