腦缺血再灌注損傷大鼠Beclin-1與Bcl-xL、Caspase-2的表達及Cystatin C干預作用的影響

陳 萌， 梁秀軍， 王愛樂， 常曉棟， 楊嘉磊

腦缺血再灌注損傷大鼠Beclin-1與Bcl-xL、Caspase-2的表達及Cystatin C干預作用的影響

陳 萌1， 梁秀軍2， 王愛樂3， 常曉棟4， 楊嘉磊4

目的探討大鼠腦缺血再灌注后自噬蛋白Beclin-1與凋亡蛋白Bcl-xL、Caspase-2表達的變化以及Cystatin C對其的干預作用。方法Sprague-Dawley大鼠雄性60只隨機分成假手術組(sham)、模型組(model)、Cystatin C低(low)、中(middle)、高(high)濃度組，每組12只。用線栓法制備大鼠右側局灶性腦缺血2 h再灌注24 h模型。各組大鼠進行神經損傷嚴重程度評分(mNSS)，Western Blot檢測損傷區腦皮質組織中凋亡相關蛋白Bcl-xL、Caspase-2的表達；免疫熒光法檢測Beclin-1蛋白表達的平均熒光強度；TUNEL法觀察神經細胞的凋亡指數(AI)。結果與模型組相比，Cystatin C低、中濃度組中Bcl-xL的表達較模型組明顯升高(P<0.05)，Caspase-2的表達降低(P<0.05)；而Cystatin C高濃度組Bcl-xL表達明顯降低，Caspase-2的表達則顯著上升(P<0.05)；Cystatin C低、中、高濃度組Beclin-1的表達逐漸升高(P<0.05)。結論應用低、中濃度的Cystatin C干預腦缺血再灌注損傷大鼠后，自噬的增強能夠促進Bcl-xL的表達，抑制Caspase-2的表達；而高濃度的Cystatin C使Caspase-2的表達增強，Bcl-xL的表達降低。

腦缺血再灌注； 自噬； Caspase-2； Bcl-xL； Beclin-1

Abstract：ObjectiveTo investigate the expressions of autophagy related proteins Beclin-1 and apoptosis related proteins Bcl-xL、Caspase-2 after focal cerebral ischemia-reperfusion with Cystatin C pretreatment in rats.Methods60 male SD rats were randomly divided into sham operation group，the model group and Cystatin C pretreatment group(Cystatin C 2 mg/l，5 mg/l，10 mg/l，respectively)，12 rats in each group. The model of right middle cerebral artery occlusion(MCAO) was established by thread embolism. After ischemia for 2 h and reperfusion 24 h，the Modified neurological severity scores (mNSS) were tested. All rats were killed at 24 h after MCAO. The brains were removed and using Western Blot method to detect apoptosis related proteins Bcl-xL and Caspase-2，located in the center area of the cerebral cortex tissue injury；Beclin-1 protein expression was detected by immunofluorescence method，and TUNEL method was used to evaluate the apoptosis of neuron.ResultsCompared with model group，the expression of Bcl-xL had different degree of increase in the Cys low and Cys middle group(P<0.05)，the expression of Caspase-2 decreased(P<0.05)；While the expression of Caspase-2 in the Cys high group was higher than the Cys low and Cys middle group(P<0.05)，the Bcl-xL was obviously lesser(P<0.05)；the expression of Beclin-1 protein in the each concentration Cystatin C group increased gradually(P<0.05).ConclusionLow and middle concentration of Cystatin C intervention ischemia reperfusion injury in rats，the activity of autophagy increased could promote the pression of Bcl-xL，inhibit the expression of Caspase-2.While high concentration of Cystatin C (reach a certain degree of autophagy flow) could inhibit the expression of Bcl-xL，promote the expression of Caspase-2.

Keywords： Cerebral ischemia reperfusion； Autophagy； Beclin-1； Bcl-xL； Caspase-2

腦卒中(Stroke)又叫腦血管意外，是一種突然起病的腦血液循環障礙性疾病，臨床上分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中。在國內的腦血管疾病患者中，缺血性腦卒中患者可達66.4%[1]。腦缺血后繼發性腦損傷將嚴重影響患者預后并導致病情加重，其主要參與原因包括炎癥反應、細胞凋亡、興奮性氨基酸毒性、自噬及鈣超載等等。自噬在缺血再灌注損傷時是一把雙刃劍，當細胞啟動適度的自噬來清除受損細胞器時，對細胞主要起保護作用，但當不完全或過度自噬發生時可能導致細胞死亡[2]。半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(Cystatin C，Cys C)已證實可以誘導細胞自噬，從而保護小鼠皮質神經元[3]。本實驗預先給予大鼠不同濃度的Cystatin C進行處理，然后建立局灶性腦缺血再灌注損傷模型，研究其對大鼠腦缺血再灌注損傷后神經細胞自噬蛋白Beclin-1和凋亡蛋白Bcl-xL、Caspase-2表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組及處理 清潔級SD雄性大鼠60只，體質量260～280 g。購自北京維通利華生物技術有限公司。大鼠隨機分為5組：假手術組、模型組、Cystatin C低、中、高濃度組，每組12只。Cystatin C各組分別于術前1h經鼠尾靜脈給予Cystatin C 2 mg/L，5 mg/L，10 mg/L，假手術組和模型組給予等量的生理鹽水。

1.2 實驗藥品及試劑 半胱氨酸蛋白酶抑制劑C (Cystatin C，purified) (瑞士Enzo life Science，貨號BML-SE479-0100)；鼠抗Bcl-xL單克隆IgG抗體(美國Santa Cruze，貨號sc-8392 )、Caspase-2羊多克隆抗體IgG(美國Santa Cruze，貨號sc-1217)和兔抗Beclin-1試劑(日本 MBL，貨號 PD017)；HRP 標記的羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋，貨號 ZB-2305)；HRP 標記的驢抗羊IgG(美國Santa Cruze，貨號sc-2020)；BCA 法蛋白定量試劑盒 (杭州聯科生物技術股份有限公司，貨號70-M-PQ0012)。垂直電泳系統(Bio-Rad，USA)；石蠟切片機(德國Leica，型號 RM2235)；倒置熒光顯微鏡(德國Leica，型號 DMI4000B)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)模型制備 SD大鼠經適應性喂養1 w后，禁食12 h，自由飲水。用10%的水合氯醛腹腔麻醉(300 mg/kg)。模型組和Cystatin C各組采用線栓法制備MCAO模型。大鼠常規麻醉、消毒，取頸部正中切口，分離右側頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸外動脈(external carotid arter，ECA)和頸內動脈(internal carotid artery，ICA)。用微動脈夾夾閉CCA和ICA，在ECA殘端用眼科剪剪一小口，將制備好的線栓通過ECA殘端插入，去掉ICA的微動脈夾后，插入ICA的顱內段。注意觀察線栓方向避免誤入翼腭動脈，線栓進入(18.5±0.5) mm，當有輕微阻力時停止。線栓正好進入顱內大腦前動脈，阻塞大腦中動脈的開口。術后將大鼠單籠飼養，燈照保暖至大鼠蘇醒。血流阻斷2 h后拔出線栓，實現再灌注。假手術組大鼠僅分離右側血管，不插入漁線。

1.3.2 神經行為學評分 各組大鼠于術后24 h分別進行改良神經損傷嚴重程度評分(modified neurological severity scores，mNSS)。該評分包括運動、感覺、反射等方面，依據其損傷程度分為0分到18分：0分表示無神經功能缺損，18分表示功能缺損最嚴重。神經功能損傷的程度隨分值增大而逐漸加重。評價模型制備成功率。

1.3.3 Western Blot檢測大鼠腦皮質組織中Bcl-xL和Caspase-2蛋白水平 將各組大鼠經10%水合氯醛麻醉后，預冷0.01 mol/L PBS心臟灌流后，斷頭取腦。分離缺血再灌注損傷側腦皮質組織，假手術組取相應部位腦組織。加入RIPA裂解液1 ml進行裂解、于冰上勻漿，4 ℃離心后取上清液，BCA法進行蛋白定量。每道蛋白40 μg上樣，經過SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉、分別加入TBST稀釋的一抗：鼠抗Bcl-xL單克隆抗體(1∶500)、Caspase-2羊多克隆抗體(1∶500)、小鼠抗β-actin單克隆抗體(1∶1000)。4 ℃孵育過夜。次日洗膜后分別加入對應的二抗：辣根過氧化酶標記的羊抗小鼠IgG(1∶2000)，辣根過氧化酶標記的驢抗羊IgG(1∶2000)，室溫孵育1 h。使用增強型免疫發光法(ECL)曝光顯影條帶。采用Image-Pro-Plus 6.0軟件對條帶進行分析，以目的蛋白與內參β-actin的積分光密度(IOD)比值作為目的蛋白的相對表達水平。

1.3.4 免疫熒光法檢測Beclin-1的表達 大鼠經斷頭取腦后置于4%多聚甲醛中繼續固定24 h。冠狀切下腦組織塊，常規脫水，石蠟包埋。切片厚約為5 μm的薄片，經二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后，加入0.25%TrionX-100室溫處理破膜。PBS搖洗3次，蒸餾水浸泡切片5 min，將切片放入檸檬酸緩沖液中(95～98 ℃) 20 min進行抗原修復，恢復至室溫后取出切片，PBS浸泡5 min，10%正常山羊血清封閉60 min。加入一抗兔抗Beclin-1多克隆抗體(1∶100稀釋)，室溫孵育1 h后4 ℃過夜。次日取出常溫放置30 min，PBS洗片后滴加(1∶200稀釋)Alexa Fluor?594-羊抗兔IgG熒光二抗，暗室孵育60 min。PBS避光搖洗5min × 3次，加入Hoechst(1∶1000)，室溫10 min，PBS搖洗3次終止染色。50%緩沖甘油封片，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。用PBS代替一抗、熒光二抗作為陰性對照，其余步驟同上。于高倍視野下拍攝5個互不重疊視野下的照片，計算陽性細胞數目，取其平均數。

1.3.5 TUNEL法檢測神經細胞凋亡 采用脫氧核苷酸末端轉移酶(TdT)介導的原位末端標記法(TUNEL)檢測凋亡細胞。標本預處理后經蛋白酶K室溫孵育15 min，PBS沖洗3次，滴加50 μl的TUNEL反應混合物后于37 ℃孵育60 min。PBS沖洗3次，滴加轉化劑37 ℃孵育30 min進行信號轉化。PBS沖洗3次，加入DBA底物室溫孵育8 min。PBS沖洗3次后蘇木素復染，蒸餾水沖洗，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。每張切片隨機選取不重復5個于200倍視野下進行凋亡細胞計數。計算凋亡細胞指數，結果取其均數。凋亡細胞指數(AI)=陽性細胞數/總細胞數 × 100%。

2 結 果

2.1 各組大鼠進行神經損傷嚴重程度評分 各組大鼠模型制備前mNSS評分均為0分。假手術組mNSS評分差異均無統計學意義(P>0.05)，評分多為0～2分；模型組大鼠24 h均出現缺血側同側Horner征及對側肢體的典型偏癱癥狀，表現為：站立不穩，向左側傾倒或轉圈，提起鼠尾可見左前肢屈曲，mNSS評分在10～13分，評分數值明顯高于假手術組(P<0.05)，提示模型組大鼠神經功能受損嚴重。與模型組比，模型組大鼠mNSS評分明顯減少(P<0.05)，而Cystatin C高濃度組mNSS評分與模型組無明顯差別(P>0.05)。說明Cystatin C低、中濃度可改善腦缺血再灌注后大鼠神經功能缺損癥狀，促進運動功能的恢復；而Cystatin C高濃度組大鼠神經功能缺損癥狀明顯(見表1)。

組別劑量(mg/kg)神經損傷嚴重程度評分假手術組模型組CysC低濃度組CysC中濃度組CysC高濃度組25101.00±0.73911.33±1.0739.42±1.165a8.33±0.651ab12.00±0.953c

a：P<0.01 vs 模型組；b：P<0.05 vs Cys C 低濃度組；c：P>0.05 vs 模型組

2.2 Western Blot檢測Bcl-xL和Caspase-2表達情況 Western Blot檢測結果顯示：假手術組有少量Bcl-xL表達；模型組Bcl-xL的表達升高，Caspase-2表達也增高；Cystatin C低、中濃度組Bcl-xL表達較模型組有不同程度的增加(P<0.05)，Caspase-2表達較模型組有所降低(P<0.05)；而Cystatin C高濃組Bcl-xL的表達較Cystatin C低、中濃度組有所降低，Caspase-2表達較低、中濃度組表達明顯增加(P<0.05)(見圖1)。

假手術組 模型組 Cys C低 Cys C中 Cys C高

假手術組 模型組 Cys C低 Cys C中 Cys C高

假手術組 模型組 Cys C低 Cys C中 Cys C高

n=6，a：P<0.01 vs 假手術組，b：P<0.05 vs 模型組，c：P<0.05 vs Cys C 低濃度組，d：P<0.05 vs Cys C中濃度組

圖1 每組大鼠Bcl-xL、Caspase-2的蛋白印跡結果

2.3 免疫熒光染色檢測腦皮質Beclin-1平均熒光強度 免疫熒光染色結果顯示：Beclin-1蛋白主要分布在細胞質，在腦皮質呈彌散性分布，陽性物質呈紅光，藍光顯示的為Hoechst染的細胞核。假手術組Beclin-1的熒光強度較弱，模型組Beclin-1的熒光強度較假手術組有所增強；不同濃度的Cys C各組Beclin-1的熒光強度呈現出逐漸增高的趨勢(P<0.05)(見表2、圖2)。

2.4 TUNEL法檢測神經細胞凋亡結果 光學顯微鏡下觀察：TUNEL染色陽性細胞核呈棕黃色，正常細胞染成藍色。假手術組幾乎沒有陽性凋亡細胞，模型組細胞凋亡數目明顯增多，凋亡指數較高(P<0.01)；Cystatin C低、中濃度組凋亡指數較模型組有所降低(P<0.05)，而Cystatin C高濃度組細胞凋亡指數較低、中濃度組明顯增高(P<0.05)(見表2、圖3)。

組別Beclin-1凋亡指數(%)假手術組模型組CysC低濃度組CysC中濃度組CysC高濃度組0.0305±0.00330.0585±0.0047acd0.0868±0.0056abd0.1151±0.0380abc0.1456±0.0352abcd1.14±0.0228.95±1.68acd18.40±0.81abd15.96±0.60abc22.86±1.04abcd

a：P<0.01 vs 模型組；b：P<0.05 vs 模型組；c：P<0.05 vs Cys C低濃度組；d：P<0.05 vs Cys C中濃度組

3 討 論

細胞凋亡是一種程序性細胞死亡，它的主要功能是清除機體內損傷或過多的細胞，從而有助于機體的存活。Caspase為天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，是一類進化上高度保守的半胱氨酸蛋白酶家族。Caspase依賴的凋亡途徑是細胞程序性死亡的一種重要方式，其中Caspase-2是最保守的Caspase家族成員之一。

有文獻報道Caspase-2位于Caspase-3的上游，在凋亡的發生中其先于Caspase-3被激活[4～6]。Imre等[7]發現Caspase-2為凋亡啟動因子并促使細胞發生凋亡，當Caspase-2的表達下調可抑制細胞凋亡。Bcl-2蛋白家族通過線粒體通透性繼而引起Caspase活化，在應激誘發的凋亡中Caspase-2對Bax轉位到線粒體是必須的，說明線粒體的通透性受到Caspase-2的調控[8，9]；在Fas抗體誘發的凋亡中，Caspase-8的活化和下游Bid酶切活化、DNA片段化均需Caspase-2的存在。活化的Caspase-2可以直接或者間接通過酶切Bid誘發線粒體中凋亡相關蛋白Cyt-C、Smac和AIF釋放，且呈劑量依賴關系[10]。其中Cyt-C與Apaf-1和proCaspase-9形成凋亡信號復合體使Caspase-9活化，繼而下游效應Caspase活化引發細胞凋亡[11]。

Bcl-xL是Bcl-2家族中重要的凋亡抑制基因。Bcl-xL作為上游凋亡相關因子能夠抑制Caspase的激活及調控活性氧的毒性發揮和維持線粒體膜電位來阻止細胞凋亡[12]，也可以通過抑制死亡誘導信號復合體組裝抑制Caspase的活化[13]。Beclin-1是一種可以引導自噬蛋白定位于自噬小體，從而幫助其形成自噬小體雙層膜結構的蛋白，也被稱為自噬相關蛋白-6(autophagyrelatedgene-6，ATG-6)。主要參與哺乳動物自噬體的早期形成，也可以促進自噬小體水解蛋白。另外Beclin-1存在BH3結構域蛋白，Bcl-2蛋白家族中的Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w能與BH3結構域結合，抑制其抗凋亡作用；Bcl-2蛋白的功能受其蛋白產物Bax和Bcl-xL蛋白的調控。因此，Beclin-1是一個參與自噬與凋亡雙重途徑的調節因子，它參與調節途徑的不同最終決定細胞在外界刺激下是進入自噬還是凋亡。

有文獻表明，經凋亡誘導劑處理的過表達Bcl-2細胞中有自噬體大量出現，提示在Bcl-2高表達時會激活自噬[14]；在Bcl-2/Bcl-xL過表達的細胞系中，缺血也能夠誘導自噬的發生[15]；Xu等[16]發現，自噬的激活伴隨著Bcl-2蛋白的上調，增加的Bcl-2可能阻止營養剝奪條件下的自噬的過度激活和細胞死亡。Tang等[17]在研究脊髓損傷時發現，損傷大鼠經腹腔注射mTOR抑制劑Rapamycin后能增強自噬蛋白Beclin-1和LC3的表達，促進脊髓損傷神經元和膠質細胞中自噬的發生。其對神經修復的主要發生機制為：自噬的抑制能夠抑制Bcl-2的表達，促進Bax的表達，自噬的增強能夠促進Bcl-2的表達，抑制Bax的表達。這些結果說明Bcl-2并不是在所有條件下都抑制自噬的激活。所以抗凋亡蛋白Bcl-2家族和自噬之間的關系還需要進一步的研究。

Cystatin C是一種蛋白酶抑制劑，可以抑制mTOR通路誘導功能性自噬，有實驗證明對腦損傷有保護作用[18]。在我們的前期研究結果中也發現，

圖2 各組大鼠Beclin-1 免疫熒光染色結果(×400)

假手術組 模型組 Cys C低濃度組 Cys C中濃度組 Cys C高濃度組

圖3 各組大鼠TUNEL染色結果(×200)

Cystatin C在一定濃度范圍內可使腦缺血再灌注損傷大鼠的神經功能缺損癥狀明顯減輕，腦梗死區體積減少(P<0.01)，而高濃度的Cystatin C則引起自噬過度激活致腦損傷加重[19]。在本實驗中探討Cystatin C預處理后對Beclin-1和相關凋亡蛋白的影響機制，應用低、中濃度的Cystatin C預處理后，可增強神經細胞自噬蛋白Beclin-1的表達，使神經細胞凋亡數目減少，Bcl-xL的表達增加，Caspase-2的表達降低，從而對損傷的神經細胞起到保護作用；而高濃度Cystatin C預處理后則Bcl-xL的表達降低，Caspase-2的表達升高，神經細胞凋亡數目明顯增加，導致腦損傷加重。Bcl-2蛋白及其家族成員在腦缺血再灌注損傷神經元凋亡與自噬的病理機制中起著非常重要的作用，其在不同組織和細胞相關信號通路中所產生的的協調或拮抗作用機制，尚需進一步的研究。找準作用靶點，以此治療和挽救腦卒中患者的神經功能缺失癥狀，可能會成為將來臨床治療中新的思路和治療理念。

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EffectsofCystatinCpretreatmentonautophagyproteinBeclin-1andapoptosisrelatedproteinBcl-xL、Caspase-2aftercerebralischemia-reperfusioninrats

CHENMeng，LIANGXiujun，WANGAile，etal.

(DepartmentofElectronMicroscopeofBasicMedicalCollege，Chengde067000，China)

1003-2754(2017)09-0801-06

2017-03-20；

2017-06-20

河北省自然科學青年基金項目(No. H2015406046)；承德醫學院大學生科研項目(No. 201510)

(1.承德醫學院基礎醫學院電鏡室，河北 承德 067000；2.承德醫學院基礎醫學研究所，河北 承德 067000；3.承德市中醫院ICU室，河北 承德 067000；4.承德醫學院2014級本科，河北 承德 067000)

陳 萌，E-mail：chenmeng05@126.com

R743.3

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