α7神經型尼古丁受體激動劑PNU282987對APP/PS1小鼠海馬組織中DYN-Ⅰ蛋白表達的影響

王曉玲， 鄧于新， 董陽婷， 官志忠，， 齊曉嵐， 王 凡

α7神經型尼古丁受體激動劑PNU282987對APP/PS1小鼠海馬組織中DYN-Ⅰ蛋白表達的影響

王曉玲1，2， 鄧于新1，2， 董陽婷3， 官志忠1，2，3， 齊曉嵐1，2， 王 凡4

目的研究特異性激動APP/PS1轉基因小鼠腦組織中α7神經型尼古丁受體(α7 nAChR)水平后對海馬組織DYN-Ⅰ蛋白的影響；探討α7 nAChR在阿爾茨海默病 (Alzheimer disease，AD) 發病機制中的神經保護作用機制。方法實驗動物分為對照組(Control)、野生加PNU282987組(WP)、APP/PS1轉基因組(APP/PS1)和APP/PS1加PNU282987組(AP)各8只，WP和AP組給予α7 nAChRs 特異性激動劑PNU-282987，另兩組給予生理鹽水，給藥方式為小鼠24 w齡時1 mg/kg腹腔注射PNU-282987，連續5 d。采用 Real-time PCR 法和蛋白免疫印跡 (Western Blot) 法分別測定小鼠海馬組織中發動蛋白Ⅰ(DYN-Ⅰ) mRNA 和蛋白表達水平的變化。結果與control組相比，APP/PS1組海馬組織中發動蛋白Ⅰ(DYN-Ⅰ) mRNA 和蛋白水平下降(P<0.05，P<0.01)；而特異性激動α7 nAChR水平后，與對照組相比WP組中發動蛋白Ⅰ(DYN-Ⅰ) mRNA 和蛋白水平升高(P<0.05，P<0.01)；與APP/PS1組相比AP組小鼠大腦海馬組織中發動蛋白Ⅰ(DYN-Ⅰ) mRNA 和蛋白水平明顯升高(P<0.01，P<0.01)。結論特異性激動APP/PS1轉基因小鼠海馬組織中α7 nAChR水平能夠使網格蛋白內吞調節蛋白DYN-Ⅰ表達升高。這可能提示了α7 nAChR對突觸有一定的保護作用，進一步說明α7 nAChR在阿爾茨海默病的發病中起著重要作用。

α7 神經型尼古丁受體； 阿爾茨海默病； APP/PS1轉基因鼠； DYN-Ⅰ

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of specially agonism 7 neural nicotinic acetylcholine receptors (nAChR) on the expression of DYN-Ⅰ protein in the hippocampus of APP/PS1 transgenic mice，and to explore the neuroprotective role of 7nAChR in the pathogenesis of Alzheimer’s disease ( AD).MethodsExperimental animals were divided into four groups：Control group，Wild plus PNU282987 group (WP)，APP/PS1 group and APP / PS1 plus PNU282987 group，8 mice each group，WP group and AP group were given with α7nAChRs specific agonist PNU-282987，the other two groups were given with saline for control，All groups were injected intraperitoneally for continuous 5 days at a dose of 1 ml / kg at 24 weeks old. After this the mRNA and protein level of dynamin Ⅰ (DYN-Ⅰ) in hippocampus of mice were detected by Real-time PCR and Western Blotting respectively.ResultsCompared with the control group，the mRNA and protein levels of dynamin Ⅰ (DYN-Ⅰ) in the hippocampus of the APP/PS1 group were decreased (P<0.05P<0.01)；After specially agonism α7nAChRs with its specific agonist PNU282987，we validated the levels of dynamin Ⅰ (DYN-Ⅰ) mRNA and protein were increased compared with the control group (P<0.01P<0.01)；Compared with the APP/PS1 group，the mRNA and protein levels of dynamin Ⅰ (DYN-Ⅰ) in the hippocampus of the AP group were increased (P<0.01P<0.01).ConclusionSpecially agonism the level of α7 nAChR in hippocampus of APP/PS1 transgenic mice can increase the expression of dendritic regulatory dynamin Ⅰ protein (DYN-Ⅰ). The result indicates that α7nAChR has a protective effect on synapse，suggesting that the receptor might play an important neuroprotective role in the pathogenesis of AD.

Keywords： α7 nAChR； AD； APP/PS1 transgenic mouse； DYN-Ⅰ

阿爾茨海默病 (Alzheimer’s disease，AD)是一種以智力緩慢性進行性喪失為特征的神經退行性變疾病，其主要臨床表現為記憶力進行性降低，精神和性格異常，社會交往和適應能力降低。當前，AD 已成為繼續心腦血管疾病后威脅我國老年人健康的又一重要病種。其主要神經病理特征為細胞外β-淀粉樣蛋白 (β-Amyloid protein，Aβ)沉積所形成的老年斑、細胞內異常磷酸化的微管相關蛋白tau蛋白聚積所形成的神經原纖維纏結、中樞膽堿能神經元的丟失及累及皮質動脈和小動脈的血管淀粉樣變性等[1]。目前對 AD 確切病因、發病機制尚未真正了解。近年來，由于 AD 轉基因小鼠模型的成功培養，為研究 AD 提供了理想的工具。神經型乙酰膽堿受體(neuronal nicotinic acetylcholine receptor，nAChR)在AD中研究較多，α7 nAChR是分布最廣的亞單位之一[2]，具有調節認知、學習、記憶等功能[3，4]，膽堿能系統障礙和神經損傷可能與α7 nAChR基因、結構及其功能異常有一定關聯[5]。有報道指出在 AD 中最脆弱的神經元是那些高表達神經型尼古丁受體的神經元，特別是含有 α7 nAChR 亞單位，且在 AD患者膽堿能系統損傷與α7 nAChR 水平下降和突觸損傷有關[6，7]，其在調節神經可塑性方面具有獨特的作用，在神經保護中起了重要的作用。有研究顯示，阿爾茨海默病患者認知功能下降與突觸聯系喪失程度表現出較好的相關性，特別是與突觸囊泡回收蛋白表達異常有關[8]。突觸囊泡的循環回收過程主要是通過網格蛋白(clathrin)介導的內吞過程完成的，需要多種蛋白協調完成，而 DYN-Ⅰ就是其中一個重要蛋白。DYN-Ⅰ是Dynamin家族中的重要一員，它參與到網格蛋白介導的突觸囊泡的內吞過程，在內吞回收突觸囊泡過程中至關重要[9]。因此，本課題通過特異性激動APP/PS1轉基因鼠腦組織α7 nAChR水平來研究在 AD 發病機制中，α7 nAChR的水平對DYN-Ⅰ蛋白表達的影響進行研究，進一步探討這些改變之間是否具有一定的相關性，為進一步闡明 AD 發病機制提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 AD轉基因動物模型鑒定 雄性阿爾茨海默病APPswe/PSldE9雙轉基因模型小鼠(B6.Cg-Tg)及同背景雌性野生型小鼠，體重20～30 g，均購自上海南方模式生物公司[動物許可證號：SCXK(滬)2014-0002]。野生型小鼠和APP/PSl雙轉基因小鼠可配期為3～10 m，母鼠的妊娠期為 20 d左右，繁殖采用1只雄鼠與3只雌鼠同居的方式進行。成功繁殖后，當新生的小鼠年齡達到 2～3 w時剪鼠尾提取小鼠DNA，進行小鼠基因型鑒定。19～20 d后子鼠雌雄分籠飼養。實驗動物遵照國家實驗動物飼養和使用指南，采用獨立通風柜飼養，動物房房常年溫度控制在(24±2)℃，濕度40%～60%，光照時間8：00～21：30。所有動物均飼養于貴州醫科大學實驗動物中心 SPF 級環境。所有實驗操作均獲得貴州醫科大學實驗動物倫理委員會的許可。

1.2 試劑 α7 nAChRs 特異性激動劑PNU-282987購于sigma公司(美國)；兔抗α7 nAChR(H-302)多克隆抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體sc-81178、辣根過氧化物酶 (HRP) 標記的抗鼠二抗sc-2005均購于Santa Cruz 公司(美國)；兔抗dynamin1單克隆抗體 (GTX61459)、高分子量蛋白 Marker (12-170kD)購于GeneTex公司(美國)；辣根過氧化物酶 (HRP) 標記的抗兔二抗7074購于CST 公司(美國)；5×蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PMSF蛋白酶抑制劑、抗體稀釋液、封閉液均購自上海碧云天生物技術有限公司；超敏ECL化學發光試劑盒、聚乙烯二氟 (PVDF) 膜購于Amersham公司(美國)；RNA逆轉錄試劑盒購于 Thermo 公司；Firststart Universal SYBR Green Master (Rox)購于 Roche 公司(德國)；Trizol試劑購于Invitrogen 公司；2×Taq PCR MasterMix購于北京TIANGEN公司；DL2000 DNA Marker 購于日本TaKaRa公司；β-actin、DYN-Ⅰ定量PCR的引物均由上海生物工程有限公司設計并合成。

1.3 動物分組及藥物處理 本實驗將APPswe/PSldE9雙轉基因小鼠和同背景的野生小鼠分為4組各8只，雌雄各半。分別為A組：24 w野生型小鼠生理鹽水對照組(Control)；B組(WP組)：24 w野生型小鼠1 mg/kg α7 nAChRs 特異性激動劑PNU-282987處理組；C組(APP/PS1組)：24 w APPswe/PSldE9雙轉基因小鼠生理鹽水對照組；D組(AP組)：24 w APPswe/PSldE9雙轉基因小鼠α7 nAChRs 特異性激動劑PNU-282987處理組。

各組小鼠適應性飼養1 m后，B、D組在24 w齡大小時開始每日給予小鼠腹腔注射1 mg/kg α7nAChRs 特異性激動劑PNU-282987處理，A、C組只經小鼠腹腔注射等量的生理鹽水，連續注射5 d。然后腹腔注射4%水合氯醛(0.2 ml/10 g)麻醉，開胸暴露小鼠心臟，穿刺針經左心室穿刺至升主動脈，用0.01 mol/L的PBS(pH 7.4)液40 ml灌注沖洗血管床約5 min，取出小鼠大腦組織，在冰上收集小鼠海馬組織，于 -80 ℃ 冰箱保存備用。

1.4 方法

1.4.1 APP/PS1 轉基因小鼠基因型鑒定 當新生的小鼠年齡達到2～3 w時剪取鼠尾：(1)DNA提取：剪取鼠尾0.5 cm，放入標記好的 EPP管中，每管加入500 μl鼠尾裂解液和50 μl的蛋白酶K(TaKaRa)，56 ℃水浴鍋過夜，酚/氯仿法提取和純化基因組 DNA；(2)PCR反應：APP基因上游引物5’GACTGACCACTCGACCAGGTTCTG3’，APP基因下游引物5’CTTGTAAGTTGGATTCTCATATCCG3’，PS1基因上游引物5’AATAGAGAACGGCAGGAGC-

A3’PS1基因下游引物5’GCCATGAGGGCACTAATCAT3’，反應體系：上游、下游引物各0.5 μl，DNA 模板2 μl，2×Taq PCR MasterMix12.5 μl，ddH2O 8.5 μl。預變性 94 ℃ 3 min變性：94 ℃ 30 s；退火：55 ℃ 3 s；延伸：72 ℃ 1 min，共30個循環。最后延伸：72 ℃ 5 min，4 ℃保存，1.5%瓊脂糖電泳觀察PCR結果；(3) PCR產物的鑒定：PCR 產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳后進行光密度掃描，用Syngene G：BOX EF2凝膠成像儀進行觀察分析，觀察瓊脂糖凝膠上的PCR條帶，同時有400 bp和600 bp出現條帶者即為APP/PS1轉基因小鼠。

1.4.2 實時熒光定量PCR 檢測DYN-Ⅰ、β-actin mRNA 表達水平 采用Trizol一步法提取組織總 RNA，取3 μgRNA樣品用RNA逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉錄為cDNA，再以cDNA為模板進行實時熒光定量 PCR。其中DYN-Ⅰ、β-actin的引物序列見表1。用ABI Step One Plus型實時熒光定量PCR儀，采集DYN-Ⅰ、內參β-actin基因擴增各循環的熒光信號，以SDS2.1軟件收集熒光信息和分析數據。分析結果時以β-actin為內參對照，計算DYN-Ⅰ基因在實驗組與對照組的相對水平(RQ=2-△△Ct)。實驗獨立重復3次，每次3個復孔。

表1 熒光定量PCR引物序列及產物片段

1.4.3 Western印記檢測實驗小鼠海馬組織中DYN-Ⅰ蛋白表達 取各組小鼠海馬組織按RIPA∶PMSF=100∶1配制加入裂解液， 用冷凍離心機

12000 r/min、4 ℃、20 min離心，吸取上清液即為蛋白質。蛋白濃度采用BCA定量法測定；運用Western blotting法檢測DYN-1蛋白表達水平及其內參的蛋白表達情況。用ImageJ軟件進行圖片像素灰度值分析結果，計算DYN-1蛋白條帶與內參β-actin像素灰度的比值作為目的蛋白表達的相對水平。每組蛋白重復3次獨立試驗，每次3個復孔。

2 結 果

2.1 APPswe/PSldE9雙轉基因小鼠基因表型鑒定結果 見圖1。以基因組 DNA 為模板擴增，當基因組DNA同時擴增出約400 bp及600 bp大小的條帶即為APP/PS1轉基因鼠。

2.2 各組中 DYN-Ⅰ mRNA 及蛋白表達水平 結果顯示，用 Real-time PCR 和 Western blot 方法檢測到與對照組相比，APP/PS1組小鼠海馬組織中DYN-Ⅰ mRNA 及蛋白水平下降(P<0.05，P<0.01)；而經特異性激動劑PNU-282987小鼠腹腔注射后，與對照組相比WP組小鼠大腦海馬組織中DYN-Ⅰ mRNA 及蛋白表達水平升高(P<0.05，P<0.01)；與APP/PS1組相比AP組小鼠大腦海馬組織中DYN-Ⅰ mRNA 及蛋白表達水平明顯升高(P<0.01，P<0.01)(圖2A、2B)。

M為DL2000 DNA，Marker 1、3、4 是 APP/PS1 雙轉基因陽性小鼠APP基因片段為400 bp，PS1基因片段為600 bp

圖1 APP/PS1雙轉基因小鼠基因表型的鑒定

與對照組相比差異有統計學意義*P<0.05；與對照組相比差異有高度統計學意義**P<0.01；與APP/PS1模型組相比差異有高度統計學意義##P<0.01

圖2 各組小鼠海馬組織中DYN-Ⅰ mRNA (A)及蛋白表達水平(B)

3 討 論

隨著老年人口數量的逐年上升，老年性癡呆的發病率也呈現出逐年升高的趨勢，加快對該病的探索及有效的防治研究已迫在眉睫[10]。APP/PS1雙轉基因小鼠可表達突變的人類早老素(DeltaE9)和人鼠淀粉樣前蛋白(APPswe)融合體。已發現第21號染色體上有引起AD的基因，即突變的β淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid procursor protein，APP)基因；第14號染色體上有導致AD 早期發作的早老素1 (Presenilin 1) 基因和第1號染色體上早老素2 (Presinilin 2) 基因等[11]。APP是一種跨膜糖蛋白，APP的突變使得其與Aβ形成過程中的β-分泌酶的結合位點發生結構改變，導致β-分泌酶的活性升高，從而Aβ的總量增加[12]。PS1是由467個氨基酸組成的蛋白，它與PS2，Aph-l和PEN-2共同構成使γ分泌酶激活的復合體，突變PS1的產物可引起γ分泌酶的活性改變，選擇性地引起Aβ42的產生增加[13]。這說明APP/PS1雙轉基因小鼠APP和PSl基因的突變可以導致Aβ水平的升高，模擬AD的神經病理過程。

在AD病變研究中神經型尼古丁乙酰膽堿能受體(neuronal nicotinic acetylcholine receptor，nAChR)研究頗多，具有調節大腦記憶學習、智力發展、識別能力等功能和顯著的神經保護作用，對指導AD治療有一定幫助[14]。目前發現有12種nAChR 為配體門控的離子通道受體，包括α2～α10、β2～β4。α7nAChR 是腦內主要尼古丁受體，主要分布在海馬和皮質，與老年斑的常見沉積部位一致。尸檢AD患者腦中高親和力的尼古丁受體數目明顯降低，與大腦顳葉皮質老年斑的增多程度呈負相關[15]。報道指出在 AD 患者中觀察到膽堿能損傷與 α7nAChR 表達水平下降和突觸損傷有關，且最近有研究表明在老化過程中 α7nAChR對海馬突觸可塑性的重要性[16]。

近年來研究發現AD患者早期即可出現突觸數量的減少，其認知障礙程度與突觸結構和功能的改變密切相關。對AD患者的尸檢標本檢測顯示了患者腦內多種突觸蛋白表達含量下降，提示突觸功能也發生了改變，突觸功能低下或丟失可造成皮質-皮質之間的連接性受到影響或破壞，最終引起認知功能降低[17]。本課題組前期研究結果表明，穩定轉染沉默SH-SY5Y細胞α7nAChR，能使細胞突觸相關蛋白的表達減少，表明α7nAChR在SH-SY5Y細胞中的表達量的沉默將會影響突觸相關蛋白的表達[18]。研究表明，α7nAChR 對改善阿爾茨海默癥和精神分裂癥患者的認知障礙有顯著作用。因此，α7nAChR 已被確認為一種很有前途的治療目標在治療認知障礙與精神分裂癥和 AD[19]。激活的 α7 nAChR 可以調節神經元興奮性和神經遞質釋放、改變突觸可塑性，對維持記憶及認知功能的十分重要[20]。PNU是α7nAChR激動劑中特異性較高的合成物，與其他nAchR亞單位結合微乎其微，與α7nAChR結合，提高和改善AD 動物模型的認知和記憶功能[21]。DYN-Ⅰ是Dynamin家族中的重要一員，是一種相對分子質量為95kDa的三磷酸鳥苷酶( guanosinetriphosphatase，GTPase )，主要存在于突觸前囊泡膜上。現已證實 DYN-Ⅰ在細胞內吞和突觸囊泡循環中發揮重要作用，當突觸囊泡膜上網格蛋白包被后，DYN-Ⅰ對其進行機械擠壓并剪切，使突觸囊泡從突觸前膜解離，為再次神經遞質的釋放做準備，而GTPase的水解可促進剪切的進行[22]。

盡管AD的主要病理學改變是Aβ沉積形成的老年斑和神經元纖維纏結，但近年的研究結果表明突觸丟失是認知功能低下的主要危險因素之一。突觸丟失致使突觸聯系障礙，神經元與神經元之間信息傳遞中斷，學習、記憶和認知能力下降。本實驗主要研究特異性激動APP/PS1轉基因小鼠腦組織中α7nAChR水平后對海馬組織DYN-Ⅰ蛋白的影響，從而探討α7nAChR在阿爾茨海默病 (Alzheimer disease，AD) 發病機制中的神經保護作用機制。本研究選用24 w齡的 APP/PS1雙轉基因模型小鼠，實驗結果顯示APP/PS1雙轉基因模型小鼠海馬組織中DYN-Ⅰ蛋白表達下降，這與Yao等[23]的研究結果一致，表明在AD早期即已出現突觸蛋白表達含量下降。此外，本結果還顯示特異性激動α7 nAChR水平后，與對照組相比WP組小鼠大腦海馬組織中DYN-Ⅰ 蛋白表達水平升高；與APP/PS1組相比AP組小鼠大腦海馬組織中DYN-Ⅰ蛋白表達水平明顯升高。因此，我們推測可能原因是α7nAChR對突觸有一定的神經保護作用，α7 nAChR與突觸密切相關。因而，進一步研究α7nAChR對突觸活動的調控有重要的研究意義，為AD的早期診治提供一定的幫助。

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Theeffectsexpressionofα7neuronalnicotinereceptoragonistPNU282987onDYN-ⅠProteininhippocampusofAPP/PS1Mice

WANGXiaoling，DENGYuxin，DONGYangting，etal.

[KeyLaboratoryofEndemicandEthnicDiseases(GuizhouMedicalUniversity)，Guiyang550004，China]

1003-2754(2017)09-0777-05

2017-07-20；

2017-08-30

國家自然科學基金(81360178)；貴州省重大專項計劃 {黔科合重大專項字[2014]6008號}；貴州省創新計劃項目{黔教合協同創新中心[2014]06}；貴州省科技創新人才團隊[黔科通(2016)161號]；貴州省科技廳項目{黔科合LH字[2014]7153}

[1.地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室(貴州醫科大學)，貴州 貴陽 550004；2.貴州省醫學分子生物學重點實驗室(貴州醫科大學)，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫科大學附屬醫院病理科，貴州 貴陽 550004；4.貴州醫科大學附屬醫院神經外科，貴州 貴陽 550004]

王 凡，E-mail：1034309115@qq.com

R749.01

A