基于Ru（bpy）2+3/AuNPs/SWCNTs/腺苷適配體電化學發光生物傳感器用于腺苷的檢測

樊雪梅 王書民 李哲建 賈雪艷 鄭行望

摘要利用AuNPs/Nafion復合膜技術固定Ru（bpy）2+3，采用羧基化碳納米管固定氨基化腺苷適配體，制備腺甘電化學發光生物傳感器。采用循環伏安法和電化學發光法對傳感器進行表征。結果表明，此傳感器具有良好的穩定性和重現性。腺苷與傳感器作用后，腺苷與其適配體形成G四面體結構，Ru（bpy）2+3的電化學發光強度降低。在最佳實驗條件下，電化學發光強度降低量與腺苷濃度的負對數在1.0×10

Symbolm@@ 11～1.0×10

Symbolm@@ 7 mol/L范圍內呈良好的線性關系，線性方程為ΔIECL=

Symbolm@@ 890lgC-5050，檢出限（S/N=3）為5.0 × 10

Symbolm@@ 12 mol/L。對1.0 × 10

Symbolm@@ 10 mol/L腺苷平行測定11次，相對標準偏差為2.7%。用于尿液中腺苷的測定，加標回收率在 97.1%～110.0%之間。

關鍵詞電化學發光； 腺苷適配體； 腺苷

1引 言

腺苷是一種遍布人體細胞的內源性核苷，是合成三磷酸腺苷、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中間體， 可直接進入心肌， 經磷酸化生成腺苷酸，參與心肌能量代謝，同時還可擴張冠脈血管，增加血流量[1]。另外，大量研究表明， 尿腺苷可作為腫瘤的潛在生物標志物，在廣譜性癌癥診斷、手術療效評價中具有重要臨床實用價值[2]。因此對腺苷的分析檢測具有重要的理論和實用意義。目前，測定腺苷的方法有色譜法[3]、化學發光法[4]、熒光法[5，6]、電化學法[7～9]等。

適配體是利用體外篩選技術指數富集的配體系統進化技術，從核酸分子文庫中得到的寡核苷酸片段，能與多種目標物質高特異性、高選擇性的結合[10]。 Sun等[11]利用外切酶Ⅲ輔助的DNA循環和雜交鏈反應的雙重放大作用，構建了一種免標記熒光適配體傳感器用于檢測腺苷。Sun等[12]利用適配體探針與捕獲探針發生雜交，腺苷與適配體之間的特異性結合將適配體探針從雙鏈中置換下來，導致傳感界面上雙鏈數量減少，從而使吸附的亞甲基蘭數量相應減少，建立了一種電化學適配體傳感器檢測腺苷的方法。Wang等[13]構建了以腺苷適配體、二硫蘇糖醇和巰基己醇為組成的三元模式電化學阻抗腺苷適配體傳感器，并用于腺苷的檢測。電化學發光（ECL）是指一些中間體，主要是自由基離子在電的激發下產生于電極表面，繼而進行高能電子遷移反應，形成激發態而產生的一種發光現象[14]。電化學發光生物傳感器是將生物分子固定在電極上，并將生物識別分子和目標分析物結合的生物信號轉換為可檢測的ECL信號的一種分析器件。三聯吡啶釕是目前研究最為廣泛的電化學發光活性物質，然而，它本身沒有可用于標記的活潑基團，常常通過衍生物或以納米粒子為載體而實現標記[15]。目前，利用ECL適配體傳感器檢測腺苷已有報道，如孫波等[16]將捕獲探針通過與酰胺氯交聯共價鍵合到修飾了對氨基苯磺酸的石墨電極表面，設計了一種基于夾心式檢測腺苷的ECL適配體傳感器。Lin等[17]建立了基于硅納米粒子對聯吡啶釕電化學發光信號放大作用的腺苷適配體ECL傳感器。Li等[18]利用Rusilica 納米材料的 ECL 信號高以及 Ru（bpy）2+3二茂鐵體系的猝滅效率高的優點，建立了一種信號閉合型ECL 腺苷適配體傳感器。Chen等[19]利用含有RuSi NPs和腺苷適配體片段的ss DNA1與二茂鐵標記的 ss DNA2 互補雜化，腺苷與腺苷適配體特異性結合，使得標記有猝滅劑的腺苷適配體從電極上脫落，使得 ECL 信號得到恢復，建立了檢測腺苷的新方法。但上述幾種方法各有缺點， 如操作復雜、線性范圍較窄或檢出限較高等。

本研究制備了AuNPs/SWCNTs/Nafion復合膜，Ru（bpy）2+3通過靜電吸附固定于復合膜上，腺苷適配體與SWCNTs通過酰化反應固定于AuNPs/SWCNTs/Nafion/Ru（bpy）2+3上，制備得到ECL適配體生物傳感器， 此傳感器具有良好的穩定性和重現性。 腺苷與傳感器作用后，腺苷與腺苷適配體形成G四面體結構，導致Ru（bpy）2+3遠離電極表面，電化學發光強度降低，從而實現腺苷的定量檢測。本方法與文獻報道的ECL方法比較，具有操作簡單、線性范圍寬等優點。

2實驗部分

2.1儀器和試劑

MPIE型電致化學發光分析系統（西安瑞邁電子科技有限公司）；Zennium電化學工作站（德國Zahner公司）； UV1600PC 紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；JEM2100型透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）；RT5 POWER電磁攪拌機（德國IKA公司）；WF300D超聲波清洗機（寧波海曙五方超聲設備有限公司）；TDL802B型離心機（上海安亭科學儀器廠）；PTRO 10L實驗室超純水設備（上海品拓環保工程設備有限公司）。采用三電極系統：工作電極為裸玻碳電極或修飾電極，Pt絲為對電極，Ag/AgCl電極（飽和KCl 溶液）為參比電極。

腺苷適配體序列（5′ AGA GAA CCT GGG GGA GTA TTG CGG AGG AAG GT （CH2）7NH23′），根據文獻[20]設計，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。羧基化單壁碳納米管（SWCNTs，中國科學院成都有機化學有限公司，COOH含量2.73%，長度5～30 μm，純度>90%）。三聯吡啶釕、Nafion、N羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1（3二甲氨基丙基）3乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和氯金酸（Sigma公司）。腺苷（上海生工公司）。其它試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

1.0 × 10

Symbolm@@ 4 mol/L腺苷適配體溶液的配制： 腺苷適配體于12000 r/min離心8 min后，以29 μL 0.1 mol/L PBS緩沖溶液（pH 7.4）溶解。1.0 × 10endprint

Symbolm@@ 4 mol/L腺苷溶液的配制：準確稱取0.0010 g腺苷溶于10 mL 0.1 mol/L PBS緩沖溶液。 5 mmol/L [Fe（CN）6]3

Symbolm@@ /4

Symbolm@@ 0.10 mol/L KCl（0.10 mol/L PBS，pH=7.4）溶液；50 mmol/L TPA（0.1 mol/L PBS，pH=7.4）溶液；5 mg/mL NHS和2 mg/mL EDC溶液（0.10 mol/L PBS，pH=7.4）；0.01 mol/L Ru（bpy）2+3溶液；氯金酸：0.01%；檸檬酸三鈉：1%。沖洗液為0.01 mol/L PBS緩沖溶液（pH 7.4）。

2.2納米金的制備

采用檸檬酸鈉還原法制備納米金[21]。于250 mL錐形瓶中加入100 mL 0.01% 氯金酸溶液，加熱至沸， 加入2.75 mL 1%檸檬酸鈉溶液，繼續煮沸12 min，顏色由紫紅色變為酒紅色，停止加熱，自然冷卻至室溫。將此溶液裝入棕色瓶置于4℃保存。

2.3電化學發光生物傳感器的制備

將玻碳電極（直徑2 mm）在0.05 μm三氧化二鋁拋光粉上打磨光亮，分別在硝酸（1∶1， V/V）、 乙醇（1∶1， V/V）、 超純水中超聲3 min，干燥。AuNPs/SWCNTs/Nafion溶液的制備：準確稱取5 mg SWCNTs溶于5.0 mL 0.5% Nafion溶液中，超聲分散30 min，得到 1 mg/mL SWCNTs/Nafion分散液，將 SWCNTs/Nafion分散液和AuNPs溶液按體積比1∶1混合，超聲分散30 min，即得到AuNPs/SWCNTs/Nafion溶液。取10 μL AuNPs/SWCNTs/Nafion混合液涂滴于預處理好的玻碳電極表面，自然晾干，再滴加10 μL 1.0 mmol/L Ru（bpy）2+3于修飾好的電極上，自然晾干后得到Ru（bpy）2+3/AuNPs/SWCNTs/Nafion 修飾電極，將此電極浸泡于2 mg/mL EDC和5 mg/mL NHS的混合溶液30 min，以活化SWCNTs中的羧基，然后滴加10 μL 1.0 × 10

Symbolm@@ 5 mol/L 腺苷適配體，自然晾干后用PBS沖洗電極，得到Ru（bpy）2+3/AuNPs/SWCNTs/Nafion/腺苷適配體ECL生物傳感器，于4℃避光保存。

2.4實驗方法

將ECL生物傳感器浸入到100 μL含不同濃度的腺苷溶液中反應30 min，隨后用PBS沖洗液沖洗電極表面，以0.1 V/s的掃速在50 mmol/L TPA（0.1 mol/L PBS，pH = 7.4）溶液中使用循環伏安法檢測。根據ECL強度的減少值（ΔI = I0-IS）對腺苷進行測定（IS是ECL生物傳感器檢測腺苷的發光強度值，I0是ECL生物傳感器的空白值）。所有實驗均在室溫下進行。

3結果與討論

3.1納米金粒子的表征對制備的納米金進行了吸收光譜和透射電鏡表征。由圖1可知，納米金最大吸收波長為521 nm，這是球形納米金粒子表面等離子吸收的特征峰。如圖1B所示，納米金粒子的平均粒徑約為20 nm，且分散效果良好。

3.2傳感器檢測腺苷原理

Ru（bpy）2+3和AuNPs/SWCNTs/Nafion通過靜電吸附固定于玻碳電極表面，腺苷適配體與SWCNTs通過酰化反應固定于AuNPs/SWCNTs/Nafion/Ru（bpy）2+3上，從而制備得到ECL適配體生物傳感器。 當加入目標物腺苷時，適配體與腺苷結合， 形成G四鏈體，導致Ru（bpy）2+3遠離電極表面，從而引起ECL信號的降低。傳感器檢測腺苷原理見圖2。

出現了明顯的ECL現象，這表明Ru（bpy）2+3已固定在AuNPs/SWCNTs/Nafion/GCE表面，并表現出良好的ECL行為。將腺苷適配體修飾在Ru（bpy）2+3/AuNPs/SWCNTs/Nafion/GCE上后，ECL信號明顯降低， 表明腺苷適配體已固定在Ru（bpy）2+3/AuNPs/SWCNTs/ Nafion/GCE表面。 圖3C為Ru（bpy）2+3/AuNPs/SWCNTs/Nafion/腺苷適配體/GCE連續掃描10圈得到的ECL圖，連續掃描10圈過程中，ECL變化很小，表明修飾電極具有良好的穩定性。

3.4電化學發光生物傳感器的可行性

對ECL適配體傳感器與腺苷相互作用前后的發光強度進行了考察（圖4）。由圖4可知，傳感器與腺苷作用前電化學發光峰強度為6012（曲線a），當與1.0 × 10

3.5實驗條件的選擇

考察了體系的pH值及腺苷與傳感器作用時間對ECL強度的影響。由圖5A可知，隨反應時間的增加，ECL強度的降低值ΔI逐漸增大，到30 min時ΔI趨于平穩，再繼續增加結合時間，ΔI幾乎不變，因此選擇30 min作為反應結合時間。pH對ECL強度有一定的影響[24]。由圖5B可知，隨著pH值增大，腺苷對傳感器上釕的ECL信號抑制程序逐漸增大，當pH=7.4時，抑制程度達到最大。因此選擇pH 7.4的緩沖溶液進行實驗。

3.6干擾實驗

在優化實驗條件下，考察實際樣品中可能存在的物質對腺苷測定的影響。當腺苷濃度為1.0 × 10

7.4）. （a）blank， （b）1.0 × 10

3.8傳感器的重現性和穩定性分析

用同一支傳感器對 1.0 × 10

Symbolm@@ 10 mol/L腺苷連續測定11 次，電化學發光強度相對標準偏差為2.7%， 用同一批次的5 支傳感器對1.0 × 10endprint

Symbolm@@ 10 mol/L腺苷進行測定，電化學發光強度相對標準偏差為2.9%，說明此傳感器有較好的重現性。為考察傳感器的穩定性，使傳感器吸附一定濃度的腺苷后， 于4℃下保存，定期測定電化學發光信號值，發現電化學發光強度相比于原始發光強度，降低了2.6%，說明傳感器的穩定性較好。

3.9尿液樣品分析

取6份新鮮尿液（陜西省商洛市中心醫院提供），用0.01 mol/L pH 7.4的PBS溶液稀釋100倍作為分析試樣，按照實驗方法進行測定，同時，進行加標回收實驗，測定結果見表2。加標回收率為97.1%～110.0%， RSD為2.5%～3.5%，表明本方法可用于臨床實際樣本的檢測。

4結 論

制備了一種檢測腺苷的電化學發光適配體傳感器。首先，Ru（bpy）2+3與AuNPs/SWCNTs/ Nafion 通過靜電作用固定于玻碳電極表面，然后采用羧基化碳納米管固定氨基化腺苷適配體，制備得到ECL生物傳感器。當腺苷與傳感器作用后，腺苷與腺苷適配體形成G四面體結構，導致發光強度降低。本傳感器制備方法簡單、用樣量少， 用于腺苷的檢測，結果令人滿意。與文獻報道的ECL方法相比，本方法線性范圍較寬。本研究為生物小分子的檢測提供了一種新思路。

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Determination of Adenosine Based on Ru（bpy）2+3/AuNPs/

SWCNTs/Adenosine Aptamer Electrochemiluminescence Sensor

FAN XueMei*1， WANG ShuMin1， LI ZheJian1， JIA XueYan2， ZHENG XingWang3

1（College of Chemical Engineering and Modern Materials， Shangluo University， Shangluo 726000， China）

2（School of Chemistry and Chemical Engineering， Northwest Normal University， Lanzhou 730070， China）

3（School of Chemistry and Chemical Engineering， Shaanxi Normal University， Xi'an 710062， China）

AbstractBased on the AuNPs/Nafion composite membrane technology and immobilization of amino adenosine aptamer using carboxyl carbon nanotubes on the surface of a glassy carbon electrode， a electrochemiluminescence sensor was preparated. The sensor was characterized by cyclic voltammetry and electrochemical luminescence. The result showed that the sensor had a good stability and reproducibility. Adenosine and adenosine aptamer could form Gtetrahedral structure， leading a decrease of ECL intensity. Under the optimum experimental conditions， the relative ECL intensity showed a good linear relationship to the negative logarithm of adenosine concentration in the range of 1.0×10

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 30970696）.

第45卷2017年9月 分析化學 （FENXI HUAXUE）研究報告Chinese Journal of Analytical Chemistry 第9期1360～1366

[BW（B（S*3/4，0，）][CD44][BW）]

DOI： 10.11895/j.issn.02533820.170256endprint