農藥三氟羧草醚對小鼠肝臟和腎臟氧化損傷的研究

杜俊停，李瀟瀟，宋 靜，張 倩，陸林潔，袁均林

(華中師范大學生命科學學院 遺傳調控與整合生物學湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430079)

農藥三氟羧草醚對小鼠肝臟和腎臟氧化損傷的研究

杜俊停，李瀟瀟，宋 靜，張 倩，陸林潔，袁均林*

(華中師范大學生命科學學院 遺傳調控與整合生物學湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430079)

農藥三氟羧草醚是一種原卟啉原氧化酶的抑制劑。為了探究三氟羧草醚對小鼠肝臟和腎臟組織的氧化損傷，將24只雄性Balb/c小鼠隨機分成4組：1個生理鹽水對照組和3個劑量水平為0.1 mg·kg-1、5 mg·kg-1、250 mg·kg-1的三氟羧草醚染毒組，14 d經口灌胃染毒。制備組織勻漿液并測定組織中細胞色素c (cyt-c)、活性氧(ROS)、還原型谷胱甘肽(GSH)、脂質過氧化物丙二醛(MDA)和8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)的含量。結果表明：三氟羧草醚劑量為250 mg·kg-1時，肝臟和腎臟組織的臟器系數、ROS、MDA和8-OHdG的含量均有明顯上升(P<0.05)；細胞色素c和GSH的含量有顯著下降(P<0.05)；表明較高劑量(≥250 mg·kg-1)的三氟羧草醚能夠降低肝臟和腎臟組織中細胞色素c的含量以及可造成小鼠肝臟和腎臟組織的氧化損傷。

三氟羧草醚；肝臟；腎臟；細胞色素c；氧化損傷

Abstract：Acifluorfen is a kind of protoporphyrinogen oxidase inhibitor.In order to explore the oxidative stress on mouse liver and kidney induced by acifluorfen，we divided 24 Balb/c mice into four groups randomly:a control group and three dosage levels of acifluorfen poisoned groups (0.1 mg·kg-1，5 mg·kg-1，and 250 mg·kg-1) which were exposed by oral perfusion for 14 days.We prepared tissue homogenate， determined the contents of cytochrome c(cyt-c),reactive oxygen species(ROS)，reduced glutathione(GSH),malondialdehyde(MDA)，and 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) in tissues.The results showed that when acifluorfen dosage was 250 mg·kg-1,organ coefficients，the contents of ROS,MDA,and 8-OHdG in liver and kidney tissues increased significantly(P<0.05),whereas the contents of cyt-c and GSH decreased significantly(P<0.05).The above results showed that high doses of acifluorfen could decrease the content of cyt-c in liver and kidney tissues,and induce the oxidative stress on mouse liver and kidney.

Keywords：acifluorfen;liver;kidney;cytochrome c;oxidative stress

原卟啉原氧化酶是機體內的一個關鍵酶，參與合成亞鐵血紅素和葉綠素[1]。三氟羧草醚(acifluorfen)屬于二苯醚類除草劑，是近年來發展比較快的除草劑品種之一[2]。研究表明，在植物體內三氟羧草醚能夠降低原卟啉原氧化酶的活性[3]。三氟羧草醚引起植物的生理變化主要有：生長受到抑制、葉綠素降解增多、原卟啉Ⅸ大量積累和細胞膜遭到破壞。其作用機理主要是由于大量活性氧(ROS)產生導致脂質發生過氧化作用，因而三氟羧草醚又稱為過氧化除草劑[4]。在動物機體中，三氟羧草醚也能夠抑制肝細胞中原卟啉原氧化酶的活性，導致原卟啉Ⅸ的積累[5]。卟啉本身是一種致癌物質，具有光化學細胞毒性，過量的卟啉經照射后可形成高反應性的氧自由基，過量的氧自由基通過氧化作用破壞細胞膜結構導致細胞死亡。有8種酶參與血紅素的生物合成，其中任何一種酶的缺乏或者活性受到抑制將導致某種形式的卟啉癥。而卟啉癥與肝細胞癌存在某種聯系，卟啉癥患者發生肝細胞癌的風險增大[6]。美國EPA在2002年再次強調對三氟羧草醚的關注，將該藥歸于可能的致癌物[7]。在大鼠和小鼠體內，三氟羧草醚能夠誘導肝細胞毒性和后期的肝腫瘤[8]。Stevens等[9]研究表明，三氟羧草醚是一種過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)的激活劑，而PPARα的活化可誘導肝腫瘤的發生[10]。Kuwata等[8]實驗表明，長期的細胞毒性是三氟羧草醚引發肝腫瘤發生的重要因素，組成型雄甾烷受體(CAR)在三氟羧草醚引發的小鼠急性肝臟損傷和腫瘤發生的發展中起重要作用。目前三氟羧草醚誘導肝腫瘤發生的具體機制還不是很清楚，氧化應激能夠引發細胞毒性，也是許多疾病發展和組織損傷的重要因素和作用機制，因而肝臟氧化損傷的研究對機制的探索是十分有價值的。侯粉霞等[11]研究表明，肝臟、腎臟和血液系統可能是三氟羧草醚原藥作用于大鼠的主要靶器官。近幾年關于三氟羧草醚的毒性研究甚少，為全面認識三氟羧草醚對動物機體健康的影響，作者探究了三氟羧草醚對小鼠肝臟和腎臟的氧化損傷，為三氟羧草醚的毒性作用研究提供更豐富的信息。

1 實驗

1.1 主要試劑與儀器

2,7-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA 熒光染料，濃度99.9%)、戊巴比妥鈉，Sigma；硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)，分析純，國藥集團；小鼠細胞色素c酶聯免疫試劑盒、小鼠8-OHdG酶聯免疫試劑盒、微量還原型谷胱甘肽試劑盒、福林酚試劑盒，南京建成。

FLX800熒光酶標儀,美國Bio-Tek。

1.2 受試農藥

三氟羧草醚原藥(純度92%)，上海將來生化試劑公司。

1.3 實驗動物

24只體重約22 g的SPF級雄性Balb/c小鼠[合格證號：No.42000600013094，許可證號：SCXK(鄂)2015-0018]，湖北省實驗動物疾控中心。在實驗期間小鼠飼養于一個溫度約為21～25 ℃、濕度為51%～70%、無致病源的無菌環境中。

1.4 實驗動物的分組與染毒

24只SPF級雄性Balb/c小鼠先在無菌環境飼養7 d。7 d后隨機將小鼠分成4組:1個空白對照組，給予生理鹽水;3個染毒組，三氟羧草醚劑量分別為0.1 mg·kg-1、5 mg·kg-1和250 mg·kg-1。各組采用經口灌胃方法染毒，連續染毒14 d，染毒結束后用頸椎脫臼法將小鼠處死。

1.5 臟器系數

用鑷子將小鼠的整個肝臟和兩側腎臟取出，浸在冰冷的PBS溶液中沖洗，濾紙拭干表面水分并去除附在表面的脂肪組織，稱重并計算臟器系數：臟器系數=(臟器濕重/體重)×100%。

1.6 肝臟、腎臟組織切片的制備和觀察

用消毒過的鑷子將肝臟和腎臟取出,浸泡在濃度為10%的福爾馬林中，然后制備石蠟切片，H&E染色，最后在顯微鏡下察看肝臟和腎臟組織切片，觀察其病理學變化。

1.7 肝臟和腎臟組織勻漿

用pH值為7.5的PBS溶液漂洗肝臟和腎臟組織，用濾紙吸去其表面水分，然后加入一定量的PBS溶液制成10%勻漿液，4 ℃離心后取上清液，備用。

1.8 分析測試

1.8.1 活性氧(ROS)含量的測定

參照Crow[12]方法。各取小鼠肝臟和腎臟組織離心后的勻漿上清液4 μL，加入396 μL PBS溶液稀釋100倍。用移液槍分別加入100 μL稀釋液和DCFH-DA熒光染料于酶標板中，然后在37 ℃下避光反應10 min，最后用酶標儀檢測其熒光強度。

1.8.2 丙二醛(MDA)含量的測定

參照Draper等[13]方法。各取0.5 mL肝臟和腎臟組織離心后的勻漿上清液于小管中，加入2 mL 6%TBA進行沸水浴15 min，再用冰水冷卻，取1 mL，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液200 μL于酶標板中，測其在450 nm、532 nm、600 nm處的OD值，計算丙二醛的含量c(μmol·L-1)：c=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450。

1.8.3 還原型谷胱甘肽(GSH)含量的測定

各取400 μL肝臟和腎臟組織離心后的勻漿上清液于小管中，加入V氯仿∶V正丁醇=4∶1的有機溶劑2 mL，冰上冷卻10 min后，10 000 r·min-1離心5 min，然后取50 μL上清液于酶標板中，并加入濃度為60 ng·mL-1的150 μL DTNB，室溫下避光5 min，測其在412 nm處的OD值。空白組用50 μL PBS溶液代替上清液。

1.8.4 其它指標的測定

細胞色素c、8-OHdG以及蛋白質含量的測定嚴格按照ELISA試劑盒操作說明進行。

1.9 統計分析

實驗測得的數據用SPSS19.0軟件處理，單因素方差分析(ANOVA)用于比較多組間均數，LSD檢驗用于比較兩組間均數的差異性。

2 結果與討論

2.1 小鼠肝臟和腎臟的臟器系數的變化(圖1)

*表示P<0.05，**表示P<0.01,與對照組相比

由圖1可知，低、中劑量三氟羧草醚染毒組(≤ 5 mg·kg-1)肝臟和腎臟的臟器系數與對照組無顯著差異。高劑量(250 mg·kg-1)三氟羧草醚染毒組小鼠的肝臟和腎臟系數均明顯變大(P<0.01，P<0.05)。說明較高劑量(≥250 mg·kg-1)的三氟羧草醚可能造成小鼠肝臟和腎臟的腫大。

2.2 小鼠肝臟和腎臟組織切片觀察(圖2、圖3)

a.空白對照組 b～d，三氟羧草醚染毒組：

由圖2a可知，對照組的肝細胞排列比較有規則，即以中央靜脈為中心向外輻射狀排列；由圖2b、c可知，低、中劑量三氟羧草醚染毒組與對照組比較沒有明顯變化；由圖2d可知，250 mg·kg-1染毒組可以觀察到明顯的肝臟組織病變，如部分細胞核固縮、破裂、水解、胞漿空亮、空泡樣變、局部細胞嚴重壞死，說明250 mg·kg-1三氟羧草醚能導致肝臟組織嚴重損傷。

a.空白對照組 b～d,三氟羧草醚染毒組:

由圖3可知，低、中劑量三氟羧草醚染毒組和對照組相比，腎臟組織沒有明顯差別；250 mg·kg-1染毒組出現了腎小體數量減少、腎小體血管球增生肥大、與囊壁界限不清等癥狀。說明250 mg·kg-1三氟羧草醚也能導致小鼠腎臟組織的嚴重損傷。

2.3 細胞色素c含量的影響(圖4)

*表示P<0.05，**表示P<0.01，與對照組相比

由圖4可知，與對照組相比，染毒劑量為5 mg·kg-1和250 mg·kg-1時，肝臟組織中細胞色素c含量顯著降低 (P<0.05，P<0.01)；染毒劑量≤5 mg·kg-1，腎臟組織中細胞色素c含量無明顯差異(P>0.05)；染毒劑量為250 mg·kg-1時，肝臟和腎臟組織細胞色素c含量具有明顯差異(P<0.01，P<0.05)。表明，較高劑量(≥250 mg·kg-1)的三氟羧草醚能夠降低小鼠肝臟和腎臟組織中細胞色素c的含量。

2.4 ROS含量的影響(圖5)

*表示P<0.05，**表示P<0.01，與對照組相比

由圖5可知，低、中劑量染毒組(≤5 mg·kg-1)肝臟組織中的ROS含量與對照組相比無明顯差異(P>0.05)，250 mg·kg-1染毒組有明顯升高(P<0.01)。染毒劑量為5 mg·kg-1和250 mg·kg-1時，腎臟組織中ROS含量與對照組相比均有顯著升高(P<0.05，P<0.01)。表明，較高劑量(≥250 mg·kg-1)的三氟羧草醚能造成肝臟和腎臟組織中ROS含量的上升。

2.5 GSH含量的影響(圖6)

*表示P<0.05，**表示P<0.01，與對照組相比

由圖6可知，與對照組相比，低、中劑量三氟羧草醚染毒組(≤5 mg·kg-1)肝臟和腎臟組織中的GSH含量無統計學差異，250 mg·kg-1染毒組肝臟和腎臟組織中的GSH都有明顯降低 (P<0.01，P<0.05)。表明，較高劑量(≥250 mg·kg-1)的三氟羧草醚能造成肝臟和腎臟組織中GSH含量下降。

2.6 MDA含量的影響(圖7)

*表示P<0.05，**表示P<0.01，與對照組相比

由圖7可知，與對照組相比，低、中劑量三氟羧草醚染毒組(≤5 mg·kg-1)小鼠肝臟組織中MDA含量無統計學差異(P>0.05)，然而高劑量染毒組出現明顯升高 (P<0.05)；在腎臟組織中，染毒劑量為5 mg·kg-1和250 mg·kg-1時，MDA含量均有升高(P<0.05，P<0.01)。表明，較高劑量的三氟羧草醚能使小鼠肝臟和腎臟組織細胞的脂膜受到損傷。

2.7 8-OHdG含量的影響(圖8)

*表示P<0.05，**表示P<0.01，與對照組相比

由圖8可知，在肝臟和腎臟組織中，染毒劑量≤5 mg·kg-1，其8-OHdG含量與對照組無統計學差異(P>0.05)；然而染毒劑量為250 mg·kg-1，8-OHdG含量均有明顯的升高(P<0.01，P<0.05)。表明，較高劑量(≥250 mg·kg-1)的三氟羧草醚能使小鼠肝臟和腎臟組織細胞的DNA受到損傷。

2.8 討論

臟器系數的變動能夠反映一種有毒化學物對某組織毒性的綜合情況[14]，也是找到有毒物質主要作用靶器官的可靠依據。正常情況下，各個臟器在動物機體中的比例是相對恒定的，動物暴露于一些毒素后，如果器官受損，其重量和臟器系數會發生相應的改變。臟器充血、水腫變大以及臟器增生等病變都將引起對應的臟器系數增大；臟器萎縮或退行等病變將引起對應的臟器系數減小。本研究表明，250 mg·kg-1三氟羧草醚引起了肝臟和腎臟臟器系數的顯著升高，說明250 mg·kg-1三氟羧草醚對小鼠的肝臟和腎臟有損傷作用。

細胞色素c是由前細胞色素c和亞鐵血紅素組成[15]。細胞色素c在線粒體中有傳遞電子的功能[16]，如果細胞色素c不足，電子的傳遞將被阻斷，從而造成ATP合成減少以及生成大量的超氧陰離子[17]。另外，細胞色素c還有抵抗超氧自由基和雙氧水的抗氧化功能[18-19]。正常水平的細胞色素c含量對線粒體保持正常的氧自由基水平有至關重要的作用。本研究表明，三氟羧草醚劑量為250 mg·kg-1時，三氟羧草醚分別導致小鼠肝臟和腎臟組織中細胞色素c含量下降，這可能是肝臟和腎臟組織細胞內的氧自由基量失衡的原因之一。

ROS是一種反映細胞中氧自由基水平的重要指標[20]，動物在正常狀態下會產生適量的ROS，ROS是機體進行正常生命活動的一種重要物質，比如其參與了機體的保護、傳遞信號調控細胞分裂和分化等[21]；但過量的ROS將對機體產生一定的損傷作用，過量的ROS會攻擊氧化細胞各個組織成分，包括遺傳物質、蛋白質和脂質等，以及引發細胞凋亡，進而誘導細胞死亡。本研究表明，在三氟羧草醚劑量為250 mg·kg-1時，三氟羧草醚能夠引起小鼠肝臟和腎臟組織中ROS含量增多。

GSH在清除細胞內過量的活性氧的過程中發揮重大的作用。GSH是保護細胞免受ROS傷害的第一道防線，GSH在一定程度上能降低氧自由基的水平，還能促進修復ROS引發的生物學傷害。但是，如果細胞GSH降低到一定水平時，將導致細胞受到嚴重破壞[22]。因此GSH含量可以作為反映機體的抗氧化能力的重要指標。本研究表明，三氟羧草醚劑量為250 mg·kg-1時，三氟羧草醚能夠導致小鼠肝臟和腎臟組織中的GSH含量下降。

過量的ROS還可氧化生物膜上的脂質，造成細胞膜結構和功能發生嚴重損傷甚至導致細胞死亡。MDA可間接反映自由基水平[23]，其含量的多少代表脂質過氧化的程度和快慢[24-25]。本研究表明，在三氟羧草醚劑量為250 mg·kg-1時，三氟羧草醚能導致小鼠肝臟和腎臟組織脂類氧化產物MDA含量升高。

過量的氧自由基還可與DNA的脫氧鳥苷發生氧化反應生成8-OHdG[26]。8-OHdG是一種只能在DNA發生氧化損傷的途徑中產生的穩定性較高的氧化產物，所以8-OHdG含量的測定是一種評定DNA氧化損傷水平的可靠線索[27]。本研究表明，在三氟羧草醚劑量為250 mg·kg-1時，三氟羧草醚導致小鼠肝臟和腎臟組織8-OHdG含量明顯升高。說明高濃度的三氟羧草醚可引起小鼠肝臟和腎臟組織細胞中DNA發生氧化損傷，可能會導致小鼠組織進一步病變甚至癌變。

3 結論

研究了農藥三氟羧草醚對Balb/c小鼠肝臟和腎臟的氧化損傷，結果表明：(1)較高劑量(≥250 mg·kg-1)三氟羧草醚能夠降低細胞色素c的含量；(2)在較高劑量(≥250 mg·kg-1)的三氟羧草醚誘導之下機體產生了過量的ROS，大量的ROS攻擊細胞內的各組分，導致細胞內的抗氧化物質GSH含量下降、脂質過氧化物MDA增多和DNA發生損傷增多，造成小鼠肝臟和腎臟組織產生了一定程度的氧化損傷，而這有可能與細胞色素c含量的降低有關。

[1] 劉丹丹,牛聰偉,席真.多種屬的原卟啉原氧化酶的動力學性質研究[C]//中國化學會第30屆學術年會摘要集-第二十八分會:化學生物學,2016.

[2] 閔忠誠.新型苯并噁嗪類與嘧啶胺類化合物的合成及除草活性研究[D].武漢:華中師范大學,2006.

[3] MATRINGE M,CAMADRO J M,LABBE P,et al.Protoporphyrinogen oxidase as a molecular target for diphenyl ether herbicides[J].Biochem J,1989,260(1):231-235.

[4] KOHNO H,KATSUYAMA N,WATANABE H,et al.Callus systems to assay herbicidal peroxidation:effects of peroxidizing herbicides on habituated tobacco,nicotiana glutinosa,green cell cultures[J].Plant Biotechnology,1994,11(1):49-54.

[5] JACOBS J M,SINCLAIR P R,GORMAN N,et al.Effects of diphenyl ether herbicides on porphyrin accumulation by cultured hepatocytes[J].J Biochem Toxicol,1992，7:87-95.

[6] SARDH E,WAHLIN S,BJORNSTEDT M,et al.High risk of primary liver cancer in a cohort of 179 patients with acute hepatic porphyria[J].J Inherit Metab Dis,2013,36:1063-1071.

[7] 佚名.美國EPA重申三氟羧草醚的風險[J].農藥市場信息,2002,40(14):19.

[8] KUWATA K,INOUE K,ICHIMURA R,et al.Involvement of mouse constitutive androstane receptor in acifluorfen-induced liver injury and subsequent tumor development[J].Toxicological Sciences,2016,151(2):kfw040.

[9] STEVENS J T,STEAVENS T D,BRECKENRIDGE C B.Crop Protection Chemicals:Mechanism of Action and Hazard Profiles.In Hayes’ Principles and Methods of Toxicology [M].HAYES A W,KRUGER C L,eds.,6th ed.CRC Press,Boca Raton,FL.2014:711-824.

[10] CORTON J C,CUNNINGHAM M L,HUMMER B T,et al.Mode of action framework analysis for receptor-mediated toxicity:the peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARα) as a case study[J].Crit Rev Toxicol,2014,44(1):1.

[11] 侯粉霞,杜建雄,魚濤,等.95%三氟羧草醚原藥對大鼠的亞慢性毒性[J].毒理學雜志,2007,21(6):487-488.

[12] CROW J P.Dichlorodihydrofluorescein and dihydrorhodamine 123 are sensitive indicators of peroxynitriteinvitro:implications for intracellular measurement of reactive nitrogen and oxygen species[J].Nitric Oxide Biology & Chemistry,1997,1(2):145-157.

[13] DRAPER H H,HADLEY M.Malondialdehyde determination as index of lipid peroxidation[J].Methods in Enzymology,1990,186:421-431.

[14] 練有文，王暉，倪少凱，等.BALB/c系裸小鼠臟器重量、臟器系數的測定[J].中國比較醫學雜志，2006(5)：285-287.

[15] 許守明,陳雙喜,何艷霞.細胞凋亡與細胞色素c[J].安徽農學通報,2009,15(15):38,202.

[16] 趙云罡,徐建興.細胞色素c在呼吸鏈的多個位點以多種方式調控氧自由基代謝[C]//中國生物化學與分子生物學會會員代表大會暨全國學術會議,2001.

[17] 王艷杰,鄧雯,張鵬飛.細胞色素c與細胞凋亡研究進展[J].動物醫學進展,2012,33(7):89-92.

[18] ZHAO Y,WANG Z B,XU J X.Effect of cytochrome c on the generation and elimination of O2and H2O2in mitochondria[J].Journal of Biological Chemistry,2003,278(4):2356-2360.

[19] 徐建興.細胞色素c在線粒體中的抗氧化功能[J].中國科學院院刊,2003,18(4):277-278.

[20] 馬萍,焦銘,劉旭東,等.農藥毒死蜱對小鼠肺細胞氧化損傷的研究[J].華中師范大學學報(自然科學版),2013,47(2):246-249.

[21] ZUO H X,LI J Q,HAN B,et al.Di-(n-butyl)-phthalate-induced oxidative stress and depression-like behavior in mice with or without ovalbumin immunization[J].Biomedical & Environmental Sciences,2014,27(4):268-280.

[22] 劉志敏,熊棣,曹鳳華,等.鄰苯二甲酸單丁酯致小鼠肝臟和腎臟組織的氧化損傷[J].化學與生物工程,2014,33(8)：18-23.

[23] MORIEL P,PLAVNIK F L,ZANELLA M T,et al.Lipid peroxidation and antioxidants in hyperlipidemia and hypertension[J].Biological Research,2000,33(2):105-112.

[24] 劉羅慧.新生鼠暴露亞中毒閾劑量毒死蜱誘導腦組織氧化損傷[D].長沙：中南大學，2008.

[25] 武陽,常青,楊旭.不同濃度甲醛致大鼠肝細胞DNA氧化損傷作用[J].環境科學學報,2009,29(11):2415-2419.

[26] PANDEY R,SINGH S P.Effects of molybdenum on fertility of male rats[J].BioMetals,2002,15(1):65-72.

[27] 張少文,孫雪萍.固相微萃取印跡整體柱制備及用于尿樣中8-OHdG測定[C]// 全國生物醫藥色譜學術交流會,2010.

OxidativeStressonMouseLiverandKidneyInducedbyAcifluorfen

DU Jun-ting,LI Xiao-xiao,SONG Jing,ZHANG Qian,LU Lin-jie,YUAN Jun-lin*

(HubeiKeyLaboratoryofGeneticRegulationandIntegrativeBiology,CollegeofLifeScience,HuazhongNormalUniversity,Wuhan430079,China)

R114

A

1672-5425(2017)09-0029-06

國家自然科學基金重點項目(51136002)

2017-04-08

杜俊停(1990-)，女，河南濮陽人，碩士研究生，研究方向：環境毒理，E-mail：dujunting166@126.com;通訊作者：袁均林，副教授，E-mail:yuanjl@mail.ccnu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.09.006

杜俊停，李瀟瀟，宋靜，等.農藥三氟羧草醚對小鼠肝臟和腎臟氧化損傷的研究[J].化學與生物工程，2017，34(9)：29-34，45.