聚乙烯醇降解菌HK1菌株鑒定與降解特性

劉云柯 周云橫 陳少林

摘要 [目的]鑒定聚乙烯醇降解菌HK1并研究其降解特性。[方法]以一株能以聚乙烯醇為唯一碳源生長的細菌HK1為出發菌株，通過形態觀察和生理生化試驗對其進行鑒定，研究其對幾種實驗室常用抗生素的抗性，并通過搖瓶試驗研究其降解特性。[結果]經鑒定，該菌確定為解淀粉芽孢桿菌屬細菌，30 ℃、180 r/min搖床培養后，對培養基中PVA（1 g/L）的降解率達36.26%。HK1降解PVA的環境最優條件如下：溫度為30 ℃，底物濃度為1 g/L，pH 8.0，酵母粉添加量為2 g/L。[結論]研究結果為系統研究該菌株提供了參考。

關鍵詞聚乙烯醇；解淀粉芽孢桿菌；菌株鑒定；生物降解

中圖分類號X172文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）22-0005-04

Abstract[Objective] The aim was to identify a polyvinyl alcohol degradable bacteria HK1 and study its degradation character.[Method] We took a strain HK1 which could grow with polyvinyl alcohol as the only carbon source，identified it through its morphology and physiochemical characteristics，studied the resistance to several kinds of antibiotics which were commonly used in the laboratory，and studied its degradation character through shake flask test.[Result] According to its morphology，physiochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis，HK1 was identified as Bacillus amyloliquefaciens.It could degrade 36.26% of PVA （1 g/L） after culturing at 30 ℃，180 r/min in shaking flasks.The optimal conditions for PVA biodegradation by the obtained strain were as followed：30 ℃，1 g/L PVA，pH 8.0，and 2 g/L yeast.[Conclusion] The results can provide reference for further research of the strain.

Key wordsPolyvinyl alcohol；Bacillus amyloliquefaciens；Identification；Biodegradation

聚乙烯醇（簡稱PVA）作為一種具有獨特良好性能且可生物降解的高分子材料受到人們關注，被認為是很富前景的化工原料之一，被廣泛應用于各個領域，涉及農業、紡織、醫療、食品、建筑和高分子化工等行業，在全球范圍內的產量和消費需求都在迅速增加[1-2]。雖然PVA本身無毒性，但具有較大的表面活性，能在水中形成大量的泡沫，影響水體富氧，從而抑制甚至破壞水生生物的呼吸活動[3]，所以廢水中的PVA必須經處理后才能排放。PVA是可被某些細菌作為唯一碳源利用的乙烯基聚合物[4-9]，自20世紀70年代以來，國內外對PVA生化降解的研究十分活躍，已經分離出許多降解PVA的微生物[10]。分離PVA降解菌，擴大培養后直接用于PVA廢水處理，或者投加到活性污泥系統中的生物強化技術已成為目前研究的熱點[11]。由于PVA降解菌在大自然中并不廣泛存在，因此，進一步篩選高效降解PVA的菌種并提高其降解效率有著十分重要的研究意義。

西北農林科技大學生命科學學院獲贈一株對PVA有著較高降解效率的菌株HK1，贈送者僅對該菌株進行了16S rDNA鑒定（16S rDNA序列經比對后暫定該菌為解淀粉芽孢桿菌屬）并上傳了序列。因國內外文獻關于解淀粉芽孢桿菌對PVA的降解研究鮮有報道，筆者對該菌株的種屬進行了生物學特性鑒定，研究了該菌對幾種實驗室常用抗生素的抗性，并對其降解特性進行了研究，以期為該菌的后續研究提供基礎資料。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源。

菌株Bacillus amyloliquefaciens HK1由西北農林科技大學植物保護學院胡小平教授贈送，菌株的16S rDNA GenBank登錄號為AB279736。

1.1.2培養基。LB培養基：酵母粉 5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L（固體培養基再加入10%瓊脂粉），蒸餾水補齊，pH 7.2。

PVA基礎培養基：PVA 1.00 g/L，K2HPO4 1.60 g/L，KH2PO4 0.20 g/L，MgSO4 0.05 g/L，CaCl2 0.05 g/L，FeSO4 0.02 g/L，NaCl 0.02 g/L，NH4NO3 0.20 g/L，蒸餾水補齊，pH 7.2。固體培養基：在相應液體培養基中加入1.5%瓊脂粉。

1.1.3試劑。PVA1750（分析純）、硼酸、I2、KI、甘油、75%乙醇、葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、3% H2O2溶液、濃硫酸、2%氨水、2% AgNO3溶液、脫脂棉或濾紙、草酸銨結晶紫或石碳酸復紅、NaOH、MgSO4、無水CaCl2、FeSO4·7H2O、NaCl、蒸餾水。I2-KI溶液：I2 1 g，KI 8 g，H2O 100 mL。

1.1.4主要儀器。培養皿（9 cm直徑）、三角瓶（100 mL）、量筒（50 mL）、容量瓶（50 mL）、接種環、移液槍（100、200、1 000 μL）、比色皿、天平、恒溫振蕩搖床、紫外分光測度計、離心機、恒溫培養箱、恒溫水浴鍋、離子鍍膜儀（JEOL）、場發射掃描電子顯微鏡（Hitachi Japan）。

1.2方法

1.2.1菌種活化及菌懸液制備。將-80 ℃下保存的菌株HK1取100 μL接種于LB斜面培養基，30 ℃活化18～24 h并保存在4 ℃冰箱內。挑取活化好的菌落接種于LB液體培養基，180 r/min、30 ℃搖床培養12 h。離心收集菌體，用磷酸鹽緩沖液洗菌體3次后重懸，制成菌懸液，調節菌體濃度，使OD600在0.8左右。每次試驗前，從4 ℃保存的斜面上轉接新制菌懸液，每個月重新制備斜面保存菌種。

1.2.2菌株鑒定。 為了確認獲贈菌株的種屬信息正誤，對HK1進行形態觀察、16S rDNA序列測序、生理生化實驗[12]等，確定其分類學地位。

1.2.2.1菌落形態觀察。將培養好的HK1菌液進行適當稀釋，取10 μL均勻涂布于LB固體培養基中，并將培養皿置于30 ℃培養，待培養皿中長出適當大小的單菌落后觀察其菌落形態特征。

1.2.2.2菌株形態電鏡觀察。

將HK1菌株接種于固體培養基上培養至肉眼可見菌落形態后，在菌落上滴加5 μL無菌水，用灼燒滅菌的接種針挑散菌落。用干凈的蓋玻片覆蓋水面，使散落在水中的菌體與蓋玻片接觸。提起蓋玻片使其風干，待玻片表面沒有流動水滴后將蓋玻片放入3%戊二醛中，4 ℃過夜固定。依次用30%、50%、60%、70%、80%、90%及無水乙醇梯度脫水，每梯度浸泡10 min 2次。二氧化碳臨界干燥法過夜干燥。將干燥好的玻片粘到觀察臺上，使用離子鍍膜儀為玻璃片表面覆蓋一層金屬鉑使其導電，使用掃描電鏡觀察菌體形態。

1.2.2.3菌株16S rDNA序列測序。

采用細菌基因組DNA提取試劑盒對HK1菌株的總DNA進行提取。分別以細菌的16S rDNA基因通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′（上海英駿生物技術有限公司合成）為正、反向引物，對該菌株的16S rDNA進行PCR擴增。產物送上海英駿生物技術有限公司純化測序。測序結果使用GenBank進行Blast比對分析、整理后使用MEGA 6.0軟件構建系統發育樹，驗證菌株。

1.2.2.4生理生化特性。

參照《伯杰細菌鑒定手冊》[13]對菌株HK1進行生理生化試驗，包括糖類發酵試驗、淀粉水解試驗、明膠水解試驗、石蕊牛奶試驗、甲基紅（MR）、接觸酶試驗、NaCl耐受性試驗、纖維素水解、好氧性檢測和半固體穿刺試驗。

1.2.3對幾種實驗室常用抗生素的耐受性檢測。

1.2.3.1含抗生素的培養基制備。

滅菌后的LB固體培養基冷卻至45 ℃左右時，在超凈臺上按梯度分別向培養基內添加抗生素至終濃度（mg/L）為2.5，5.0，50.0，100.0，200.0，300.0，…，添加完畢后搖勻培養基倒平板，每種抗生素每個濃度設置3個平板重復，冷卻后備用。另外使用未添加抗生素的LB固體培養基為空白平板對照組。

1.2.3.2菌株HK1對不同抗生素的耐受檢測。

吸取5 μL活化菌株制成的菌懸液涂布于抗生素平板及空白平板上，30 ℃倒置培養，最長培養3 d以免抗生素失效，觀察并記錄菌株生長情況。對在某抗生素各濃度平板上生長正常的，逐漸增加該抗生素濃度直至獲得最大耐受濃度。

1.2.4HK1生長及PVA降解率測定。

活化好的菌株HK1接種于50 mL PVA液體培養基中，30 ℃、180 r/min培養，每隔6 h取培養液測定OD600，并另取一定量培養液進行硼酸-碘碘化鉀顯色反應（具體步驟見“1.2.6.2”），計算其降解率。

1.2.5降解條件研究。

1.2.5.1溫度對PVA降解的影響。

將活化菌株按照5%接種于PVA液體培養基，置于不同溫度（20、25、30、35、40、45 ℃）下180 r/min振蕩培養60 h，計算菌株對PVA的降解率。

1.2.5.2pH對PVA降解的影響。

將活化菌株按照5%接種于不同初始pH（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0）的PVA液體培養基中，在30 ℃、180 r/min下培養60 h，計算菌株對PVA的降解率。

1.2.5.3初始PVA濃度對PVA降解的影響。

將活化菌株按照5%接種于含不同初始PVA濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 g/L）的PVA液體培養基中，30 ℃培養60 h，計算菌株對PVA的降解率。為防止其他碳源影響，此處使用的培養基中不添加酵母粉。

1.2.5.4酵母粉濃度對PVA降解的影響。

將活化菌株按照5%接種于含不同濃度（0.5、1.0、2.0、3.0和4.0 g/L）酵母粉的PVA液體培養基中，置于30 ℃培養60 h，計算菌株對PVA的降解率。

1.2.6分析方法。

1.2.6.1菌體生物量測定。

將活化好的菌株HK1接種于PVA液體培養基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養，每隔6 h取樣于比色皿中，用分光光度計測定OD600。

1.2.6.2PVA濃度測定及降解率計算。碘-硼酸試劑法[14]：取1.2 mL培養液于1.5 mL離心管中，5 000 r/min室溫離心20 min，取上清1.0 mL于50 mL容量瓶中，加入15.0 mL 25 g/L硼酸溶液、1.5 mL I2-KI溶液，定容。室溫避光反應10 min生成綠色溶液，于690 nm波長處測定吸光度。與標準曲線進行換算，再乘以稀釋度得出殘留PVA濃度。降解率計算[14]：

降解率=（A0-A1）/A0×100%

式中，A0為空白試樣（即未接菌的空白培養基）的吸光度；A1為降解樣的吸光度。

2結果與分析

2.1菌株鑒定

2.1.1菌落形態特征。將涂布有菌株HK1的LB固體培養皿在30 ℃下培養25 h后取出，對菌落形態進行觀察。HK1在LB固體培養基上的菌落呈不規則形狀，淺黃色蠟質，不透明，表面干燥有褶皺，菌落中部隆起，邊緣呈鋸齒狀。

2.1.2菌株形態電鏡觀察。

掃描電鏡圖（圖1左）中可以清晰地看到HK1的菌體形態為橢圓桿狀，長度約為28 μm，直徑約為6 μm，圖1右為菌群狀態。

2.1.3菌株生理生化特性。HK1菌株的生理生化特性見表1。

2.1.4菌株16S rDNA序列測序。

16S rDNA序列測序結果表明，菌株HK1與Bacillus amyloliquefaciens的序列相似性達100%，結合生理生化、菌落菌株形態，可以確定HK1為解淀粉芽孢桿菌屬，驗證了捐贈者的16S rDNA鑒定結果。菌株HK1的系統發育樹見圖2。

2.2幾種抗生素對HK1菌株的致死濃度檢測

通過在含不同濃度不同抗生素平板上涂布菌株觀察生長狀況，并以無抗生素平板上的菌株生長情況為對照，檢測各抗生素對HK1菌株的致死濃度，結果見表2。

45卷22期劉云柯等聚乙烯醇降解菌HK1菌株鑒定與降解特性

2.3HK1生長曲線及PVA降解過程

活化好的菌株HK1接種于50 mL液體PVA培養基中，30 ℃、180 r/min每隔6 h取樣1 mL測定OD600和發酵液中PVA殘余濃度，并計算其降解率。由圖3可知，HK1菌株在經過約18 h后，其菌體濃度即處于最大值，隨后進入穩定期，OD600為0.265。菌株降解PVA情況：該菌株在60 h后PVA降解率達到最大，降解率為36.26%。

2.4降解條件研究

2.4.1溫度對PVA降解的影響。

不同溫度對微生物HK1降解PVA有明顯的影響。由圖4可知，在20～30 ℃時，隨著溫度的升高，菌株對PVA的降解率也隨之升高，當溫度升到30 ℃時，降解率達到最大，為15.57%。在30～45 ℃時，隨著溫度的升高，降解率逐漸降低。由此可知，HK1菌株降解PVA的最適溫度為30 ℃。

2.4.2pH對PVA降解的影響。

不同初始pH對微生物HK1降解PVA影響很大（圖5）。初始pH在6.0～9.0時，菌株對PVA均有一定的降解能力。初始pH在8.0時PVA的降解率最大。可見，HK1菌株在中性偏微堿性環境中對PVA降解效果最好，在酸性或過堿性環境中可能會抑制其生長進而影響其對PVA的降解能力。

2.4.3PVA濃度對PVA降解的影響。

碳源是菌體合成自身骨架的主要物質來源，是影響菌體生長和代謝產物合成的關鍵因素。由圖6可知，不同起始PVA濃度對微生物HK1降解率的影響很大。PVA起始濃度在0.5～1.0 g/L時，菌株對PVA的降解率隨濃度增大而升高，且起始濃度為1.0 g/L時降解率達到最大，為22.31%。當起始濃度大于1.0 g/L后，該菌株的降解效率隨濃度增大而明顯降低。有關研究表明，培養液中PVA濃度增加會導致溶液黏度的增加，可能造成培養基的溶氧量小于細胞生長代謝的需要量，從而阻礙了菌體的生長和產酶[14]。

2.4.4酵母粉濃度對PVA降解的影響。

添加有機氮源不僅有利于菌體的生長，并且能提供一些生長因子顯著提高菌體對PVA的降解能力[15]。由圖7可知，添加的酵母粉濃度在0.5～2.0 g/L時，菌株對PVA的降解率隨濃度增大而明顯升高，且濃度為2.0 g/L時降解率達到最大，為36.16%。當酵母粉濃度超過2.0 g/L后，HK1菌株對PVA的降解率有所降低。經分析，添加一定質量的酵母粉對菌株降解PVA有明顯的促進作用，而酵母粉本身成分復雜，添加量過大可能導致菌株優先利用其中的碳源進行生長而降低對PVA的利用，導致降解率下降。

3結論

西北農林科技大學植物保護學院胡小平教授獲贈的一株能以PVA為唯一碳源和能源生長的菌株HK1，經鑒定確認其為解淀粉芽孢桿菌屬（Bacillus amyloliquefaciens），其在實驗室培養條件下能顯著降解PVA，60 h的PVA降解率可達36.26%（1 g/L）。

研究了HK1的降解條件，包括溫度、pH、初始PVA濃度和酵母膏濃度對其降解PVA的影響。結果表明，其最適溫度、pH、初始PVA濃度和酵母粉濃度分別為30 ℃、8.0、1.0 g/L和2.0 g/L。

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