高寒草地土壤細菌對放牧梯度的響應

趙輕舟　余志晟

摘要放牧作為影響土壤微生物群落的重要因素，對土壤細菌的生長、活動、生存具有重要的影響。青藏高原地區放牧是主要的草地利用方式，而放牧條件改變引起的生境變化成為土壤微生物群落結構及其多樣性變化的關鍵因子。目前關于放牧對草地土壤微生物多樣性影響的結論并不統一。采用Hiseq高通量測序對放牧梯度下西藏高原典型高寒草地土壤細菌群落進行檢測發現：不同放牧梯度下土壤細菌的物種多樣性在中度放牧下最高，而均勻度沒有顯著變化。其優勢物種相對豐度隨放牧強度表現出顯著差異，其中Pseudonocardia、Sporosarcina、Thermomonas相較于中-弱放牧梯度在強放牧強度下相對豐度增大，而Rhodoplanes、Microlunatus在強放牧作用下相對豐度表現為減小。門水平上細菌類群間相關性隨放牧梯度而變化，且細菌群落結構和位置在不同放牧強度下顯示出顯著差異。

關鍵詞微生物多樣性；草地土壤；人工放牧

中圖分類號S154.3文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）22-0078-05

AbstractAs the key factors to soil microbial community，grazing influents the growth，activities and survival of soil bacteria significantly.Grazing is the premier land use pattern of Tibetan Plateau and the habitat condition transform caused by livestock grazing in Tibet turns into the key factor influent grassland soil bacteria structure and diversity.Previous researchs about the response of soil bacteria diversity to grazing were various in different grassland.The diversity and composition of the alpine grassland soil bacteria was investigated in the dual gradient of grazing with Hiseq highthroughput sequencing.The results were demonstrated as the followed：The moderate grazing increased the species richness in moderate intensity contrast to high and low grazing

intensity while the evenness of soil bacteria showed no significant change with grazing gradient.The relative abundance of dominant species showed discrepancy with various grazing intensity.Pseudonocardia，Sporosarcina，Thermomonas increased while Rhodoplanes，Microlunatus decreased in high grazed gradient than moderatlow grazed gradient.The correlation of primary phyla change with various grazing intensity and the structure and composition of soil bacteria also demonstrated the dissimilarities among heavy，moderate and low grazed gradient.

Key wordsMicrobial diversity；Grassland soil；Artificial grazing

青藏高原被稱為地球“第三極”，是世界上最高的高原地區（位于海平面4 000 m以上），具有低溫、干旱及強日照等特點，其草地生態系統由于當地的氣候條件及地球化學分布情況而變得較為脆弱和敏感，各驅動因子對其土壤微生物影響尤為強烈[1]。

放牧作為草地主要人為利用方式，在西藏展開普遍，并且西藏地區存在大量無系統放牧，包含連續放牧、固定放牧，導致放牧過程中牲畜對草地、土壤影響加劇。進入21世紀，西藏地區草地由于放牧作用導致退化日益嚴重，其中地處藏北的那曲地區和藏西的阿里地區草地退化情況而變得較為嚴重，退化面積分別達到51.28%和43.15%[2]。

土壤微生物對草地的放牧擾動十分敏感，放牧的啃食、踐踏、排泄等作用引起的生境變化對土壤微生物群落結構及其多樣性產生顯著響應[3-4]。

人工放牧作為最為典型的人為干擾因素，得到廣泛的研究，高寒、干旱區域對于水分和放牧作用的響應尤為顯著。然而當前各研究關于土壤微生物對放牧響應的結果并不統一。放牧對草地土壤的影響可分為短期和長期效應，不同放牧時間尺度下微生物群落變化差異較大。這是由于在短期尺度上，放牧的刺激增加了植物分泌物以及食草動物的糞尿排泄，輸入的糞尿可增加微生物的呼吸、礦化作用與微生物量[5]；在長期尺度上，放牧通過改變植物群落組成與凈初級生產力影響對土壤碳的輸入[6]。而特定空間尺度下放牧作用的研究較為缺乏。

基于以上背景，筆者研究了西藏高原典型高寒草地土壤細菌群落對由地上生物量與優勢物種變化表征的放牧梯度的響應，以探究在西藏地區這一干旱、寒冷、強日照環境下的小空間尺度下，人工放牧這一典型干擾因素引起的脅迫對高寒草地土壤細菌多樣性的影響。

1材料與方法

1.1試驗樣地選擇試驗樣地建立于西藏班戈觀測點。班戈觀測點位于西藏自治區那曲地區班戈縣普保鎮東北方向約10 km處（90°02′12″E、31°26′36″N，樣地平均海拔4 768 m），該觀測點地處南羌塘高原湖盆區域，屬于高原亞寒帶季風半干旱氣候區，其土壤類型為寒冷鈣土（高山草原土）。研究區為高寒草原，以紫花針茅（Stipapurpurea）為建群種，伴生有弱小火絨草（Leontopodium pusillum），其余主要物種為青藏狗娃花（Heteropappus bowerii）、平臥軸藜（Axyrisprostrat）、中亞早熟禾（Poalitwinowiana）等雜類草，樣地植被群落蓋度較低。所選研究區為典型高寒草原草地，位于較為平緩的山坡之上，坡度約為5.5°。

1.2樣點設置與樣品采集

1.2.1放牧梯度。試驗樣點設置于放牧與水分雙重梯度。于2014年8月進行采樣，依照樣地地上植物生物量與地上植被優勢物種的變化將樣地分別劃分為3個放牧梯度（HG、MG和 LG），放牧強度隨著與牧戶距離的增加逐漸顯著減小，同時各梯度的優勢物種依次變化為紫花針茅、弱小火絨草和藏嵩草。

1.2.2土壤樣品采集。

各放牧梯度均取5個平行樣品，總樣點數設置為15個。試驗于各重復樣點設置1 m×1 m樣方，每個樣方以3 cm直徑土鉆獲取樣方4角及中心的5個土壤樣品，每份土壤樣品鉆取0～20 cm深度土壤后混勻。土壤樣品通過2 mm土篩篩取以去除根、草和沙石進行前處理，以冰盒保藏進行運輸。隨后至試驗分析前，在-80 ℃冰箱中貯存。

1.3土壤和植物的理化分析

1.3.1土壤含水量。

取 10 g 鮮土樣品置于鋁盒中稱重，精確至0.01 g。在烘箱中以105 ℃將土壤烘烤12 h至恒重，移入干燥器冷卻至室溫，依據失水的質量與土壤質量比值計算土壤含水量[5]。

1.3.2土壤總氮。每個樣品稱取大約10 g的風干土，裝入100 mL的塑料方瓶中，加入50 mL 2 mol/L KCl 溶液于塑料方瓶中，將裝有土壤與KCl混合液的瓶子置于恒溫振蕩器中振蕩 1 h。將振蕩后的溶液用濾紙過濾，最后得到的上清液用流動分析儀測定銨態氮和硝態氮。

1.3.3土壤有機碳含量（TOC）。

TOC 含量用重鉻酸鉀-硫酸氧化方法分析（Nelson and Sommers 1982）。操作步驟如下： 將風干土樣過0.50 mm篩孔篩取，稱取2.000 0 g（精確至0.000 1 g）土樣，置于500 mL的錐形瓶中，將10.00 mL重鉻酸鉀標準溶液加入，輕輕搖動，使土粒分散。隨后用量筒迅速將20 mL硫酸注入至土樣懸浮液中，小心搖晃錐形瓶，令土樣和試劑充分混勻，并較為劇烈地轉動，前后搖動共1 min。

將錐形瓶靜置于石棉板上30 min（室溫20 ℃以上），隨后加入200 mL水和3～4滴鄰菲啰啉指示劑，用硫酸亞鐵銨標準溶液滴定，以溶液由橙黃色經由藍綠色至變為棕紅色為終點。

1.3.4土壤總磷。

土樣風干后過 2 mm 篩，采用高氯酸硫酸法測定土壤全磷[7]。操作步驟如下：稱量土壤樣品1 g（精確到0.000 1），并置于50 mL三角瓶內，以少量水濕潤，加入濃H2SO48 mL，搖動，放置過夜，加入70%～72%高氯酸（HClO4）溶液10滴搖勻。于瓶口處放置一漏斗，置于電爐上加熱消煮直至瓶內溶液開始轉白，繼續消煮20 min，全部消煮時間總計為60 min。

將冷卻后的消煮液用水洗至100 mL容量瓶中，用水少量多次沖冼。輕輕搖動容量瓶，待液體完全冷卻后，以水定容，使用無磷濾紙和干燥漏斗將溶液濾入干燥的100 mL三角瓶中。吸取濾液2～10 mL至50 mL容量瓶中，用水稀釋至30 mL，加入二硝基酚指示劑2滴，使用稀氫氧化鈉（NaOH）溶液和稀硫酸（H2SO4）調節pH直至溶液呈微黃色。加入鉬銻抗顯色劑5 mL，搖動混勻，用水定容至刻度線。在室溫高于15 ℃條件下放置30 min，于分光光度計上以700 nm波長比色，讀取吸光度值[7]。

1.3.5地上植物生物量。將植物樣品置于烘箱中以70°C烘烤48 h，并稱量烘干后的植物質量。

1.4DNA提取及高通量測序

使用 MoBioPowerSoil isolation kit （MoBio Laboratories，Carlsbad，CA，USA）土壤試劑盒按照其操作說明提取土壤的基因組 DNA。使用 NanoDrop ND-1000UV-Vis 超微量分光光度計（NanoDrop Technologies，Wil mington，DE，USA） 對 DNA 濃度進行定量。用細菌通用引物對V4 區域細菌16S rRNA 進行擴增，上游引物與下游引物分別為515F′ （5′-Fusion A-Barcode-CA linker-GTGYCAGCMGCCGCGGTA-3′）和909R （5′-Fusion B-TC linker-CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3′） 。 序列在V4區域全部覆蓋且精度較高[8-9]。以25 μL反應體系進行 PCR 擴增，使用 ABI GeneAmp 9700 PCR 擴增儀（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA），反應條件為：95 ℃先變性 2 min；95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 60 s，循環 30 次；最后 72 ℃延伸 5 min。擴增后的 PCR 產物用 2%瓊脂糖凝膠電泳，在 80 V 恒壓，電泳 40 min 條件下驗證 PCR 產物的正確性。將一個取樣點 3 個平行的PCR 產物等體積混合后用試劑盒純化（MP Biomedicals，CA，USA），并按照 Illu mina Hiseq 測序說明書構建 PE 文庫，加接頭后用 Illu mina Hiseq 2000 平臺進行高通量測序。

1.5測序數據分析測序原始數據先用 Trimmomatic 軟件進行剪切和質控（設置 50 bp 的窗口，從 5′端過濾掉 Q<20 的序列）。經過質控后的序列用 FLASH 軟件進行雙端序列拼接（最小 overlap 的長度設置為 10 bp，最大錯配比設置為 0.2），拼接后的連續序列再次質控以去除包含模糊堿基對及包含低質量（Q<25）的序列。選擇樣品中最小序列數進行抽平處理并后續分析。Mothur 軟件用來計算 α 多樣性指數：Chao 和 ACE 指數反映物種豐富度，Simpson 和 Shannon 指數反映物種多樣性。

同樣用 QIIME 作為軟件平臺，在統計學軟件 R 中調用 Vegan 軟件包篩選出對群落分布有顯著影響（P<0.05）的環境因子，再將這些有顯著性影響的環境因子和微生物群落結構進行主成分分析（PCA）。

2結果與分析

2.1草地土壤放牧強度變化該試驗設有放牧與水分雙重交互梯度，其中放牧梯度以地上植被覆蓋度及優勢物種的轉變為劃分依據，其放牧強度由地上植物生物量表征。結果表明HG、MG、LG梯度草地植物生物量依次增加，如圖1所示，即放牧強度由HG、MG、LG依次減小。

2.2土壤理化性質

TOC是土壤最重要的營養指標之一，TOC含量的高低可影響土壤結構，并且與土壤總氮、總磷等具有相關關系。該研究表明，西藏高寒草地土壤TOC隨地上生物量的增加而增加，即隨放牧強度的減小而增加（P<0.05）（圖2）。土壤總氮含量通常可用來衡量土壤氮素的基礎肥力[10-11]。該研究表明，高寒草地土壤總氮含量的峰值出現在中度放牧梯度，而強放牧梯度與弱放牧梯度總氮含量則顯著降低（P<0.05）（圖3）。作為草地土壤中限制草地生產力、影響放牧牧草品質的重要因素，土壤總磷含量同樣在弱放牧梯度相對于強放牧梯度更低（P<0.05）（圖4）。

2.3放牧對土壤細菌群落的影響

放牧梯度試驗樣品進行16S V4-V5區擴增后，經Hiseq高通量測序與QIIME OTU操作單元聚類操作和種屬鑒定，發現西藏高寒草地細菌類群較為豐富，且各梯度間門水平與屬水平上物種類似。各放牧梯度下土壤細菌門水平上的優勢物種分別為：放線菌門Actinobacteria（44.61%）、變形菌門Proteobacteria（21.88%）、酸桿菌門Acidobacteria（12.73%）、綠彎菌門Chloroflexi（6.57%）、芽單胞菌門Gemmatimonadetes（4.67%）和浮霉菌門Planctomycetes（2.67%）；屬水平上優勢物種分別為假諾卡氏菌屬Pseudonocardia（2.80%）、屬紅游動菌屬Rhodoplanes（1.53%）、小月菌屬Microlunatus（1.20%）、氣微菌屬Aeromicrobium（1.30%）和Candidatus nitrososphaera （1.13%）屬，放牧對于土壤細菌群落α多樣性具有顯著作用。各樣品goods coverage測序深度指數均>98.5%。代表物種豐富度的ACE、chao1指數在強放牧作用下的HG梯度較低，在中度放牧作用下的MG 梯度升高，而在弱放牧作用下的LG重新降低（圖5）。代表物種群落均勻度的Shannon指數和Simpson指數則并未在各放牧梯度間表現出顯著的分異（圖6）。

對放牧梯度下OTU操作單元數據進行Beta多樣性分析后，由PCA分析可知，強放牧作用下的HG梯度與中放牧作用下的MG梯度、弱放牧作用下的LG梯度產生一定分異（圖8）。

3討論

3.1放牧對草地地上植被和土壤理化性質的影響

土壤TOC隨著放牧強度的增加而減小，這是由于隨著放牧強度的提高，放牧過程中牧畜的啃食與踩踏作用使得地上植物、枯落物及植物根際分泌物減少，使草地土壤獲得的有機質逐漸減少。因而，土壤有機碳源由于凈初級生產力受到限制，土壤有機碳含量逐漸降低。土壤總氮在中度放牧梯度處于峰值，而重度、輕度放牧梯度則表現為谷值。土壤中氮素累積最主要的來源是土壤生物殘體的分解和土壤微生物的固定。放牧作用下，由于牧畜的踩踏作用，使氮元素的循環和轉化得到加強；同時地上植被受到牧畜啃食，草地植被覆蓋度下降，土壤溫度及水分相應發生變化，低水分條件下氣體氮流失高于植物氮積聚，而高水分條件下表現出相反的趨勢。土壤總磷表現為強放牧梯度最高，這是由于土壤中總磷主要通過牧畜的排泄進行補充，強放牧作用下牧畜排泄物為土壤增加了磷元素來源。

3.2放牧對草地土壤微生物的影響

作為西藏高寒草原最主要的土地利用方式，放牧決定了草地生產力和棲息物種的生命形式。有研究報道，地上植物生物量顯著減少以響應草地放牧作用[4]。該研究以地上植物生物量作為放牧強度的表征。研究結果發現，細菌群落物種多樣性在中度放牧梯度下最高，而強放牧作用和弱放牧作用下的各梯度土壤細菌群落物種多樣性相對較低，這與Connell[12]的中度干擾理論（intermediate disturbance hypothesis）相一致，即干擾因素對于資源以及環境一致性的作用表現為非線性，在中等水平下的干擾可使物種多樣性增加，而超過閾值之后干擾又會使物種多樣性降低。這是由于中等放牧干擾下的草地，牧畜的啃食、踩踏、排泄等活動促進了草地土壤微生物的繁殖與生長。此外，放牧作用可主要通過養分有效性和促進植物再生影響干物質、營養元素循環和C、N儲存，進而影響草地生態系統[13]，中度放牧可增加植物生產力（植物生物量+放牧引起的植物遷移量）[4]，并刺激氮元素的礦化、硝化、氨化[14]和潛在的反硝化作用[15]，使得物種多樣性增加。當放牧強度繼續增加后，地上植物生物量、土壤營養元素等性質的異質性將發生顯著的改變，導致土壤微生物的生存環境發生決定性改變，從而使得土壤細菌物種多樣性降低[16]。

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