水稻OsV3IP2和OsV3IP3原核表達與鑒定

程英+胡穎+覃永華+程鋼+王春臺

摘要：通過生物信息學分析確定OsV3IP2和OsV3IP3的可溶性肽段，獲得可溶性的OsV3IP2和OsV3IP3外源表達蛋白質，將相應的編碼區克隆于原核表達載體pET32a中，進行IPTG誘導表達，利用SDS-PAGE和Western blot檢測目的蛋白質。結果表明，利用生物信息學軟件對蛋白質的二級結構進行預測，將OsV3IP2、OsV3IP3分別分為2個和4個部分。將其分別克隆到pET32a后，采用0.2 mol/L IPTG在10、20、30 ℃誘導表達。經SDS-PAGE和Western Blot分析，證明OsV3IP2-1、OsV3IP 2-2、OsV3IP 3-1表達的融合蛋白存在于上清液中，而OsV3IP 3-2、OsV3IP 3-3表達的融合蛋白存在于沉淀中，獲得了OsV3IP2-1、OsV3IP 2-2、OsV3IP 3-1可溶性目的蛋白，為進一步體外驗證OsVDAC3與OsV3IP2、OsV3IP3的互作奠定了基礎。

關鍵詞：水稻；OsV3IP2-3；誘導表達；SDS PAGE；Western Blot

中圖分類號：S511；Q812 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）17-3349-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.17.041

Expressing and Identifying of OsV3IP2 and OsV3IP3 from

Rice in Bacterial Expression Vector

CHENG Ying， HU Ying， QIN Yong-hua， CHENG Gang， WANG Chun-tai

（South-Central University for Nationalities/Hubei provincial Key Laboratory for Protection and Application of Special Plants in Wuling Area of China， Wuhan 430074，China）

Abstract： The bioinformatic analysis was used to identify soluble fragments of OsV3IP2 and OsV3IP3，and soluble OsV3IP2 and OsV3IP3 proteins in bacterial expression systemo were btained. The corresponding coding sequences of different fragments were cloned into bacterial expression vector pET32a. The target peptides were expressed via IPTG induction，and detected by SDS-PAGE and Western blot. Result showed that from the predicted secondary structures，we identified 2 soluble fragments from OsV3IP2 and 4 soluble fragments from OsV3IP3. The expression of recombinant peptides in bacteria was induced in the presence of 0.2 mol/L IPTG at 10，20，or 30 ℃.As shown by SDS-PAGE and Western Blot analysis，OsV3IP2-1，OsV3IP2-2，and OsV3IP3-1 are in the soluble fraction of bacterial lysate，while OsV3IP3-2 and OsV3IP3-3 stay in the precipitation. We have obtained soluble peptides OsV3IP2-1，OsV3IP2-2，and OsV3IP3-1，which laid the foundation for future in vitro studies on protein-protein interactions between OsVDAC3 and OsV3IP2 or OsV3IP3.

Key words： rice；OsV3IP2-3；induced expression；SDS PAGE；western Blot

VDAC是存在于線粒體外膜上的孔道蛋白，能在膜上形成親水性電壓門控通道，是線粒體外膜主要的運輸蛋白[1]。VDAC蛋白廣泛存在于真菌到動植物的生物體中，依賴電壓調節其對陰陽離子的選擇性[2，3]。相對于動物和真菌，植物中具有較多的VDAC異構體，說明VDAC可能在植物中具有更多的特殊功能[4]。從生物中分離得到VDAC基因時發現含有多種異構體[4]，酵母只有1種VDAC，人類、鼠、兔等均有3種VDAC，模式植物擬南芥有4種，然而水稻中有8種VDAC[5]。VDAC不同亞型影響著不同的生理功能。胡穎等[6]發現YTB超表達OsVDAC3對水稻的耐鹽性和耐旱性有一定的敏感性。通過基因槍法進行亞細胞定位發現，OsVDAC3蛋白在細胞核、細胞質膜和分泌小泡上均有定位，且信號肽定位在N端[7]。另外，熊杰[8]和劉洋[9]對OsVDAC3也進行了原核和真核表達分析。武陵山區特色資源植物種質保護與利用湖北省重點實驗室前期構建了水稻膜系統酵母雙雜交cDNA文庫，并從該文庫中篩選得到了3個與OsVDAC3互作的蛋白質[6]，將其命名為OsV3IP1-3。對這3個互作蛋白質功能和亞細胞定位進行了預測。但它們是否真的同OsVDAC3發生了相互作用還需要進一步驗證。由于預測的OsV3IP1-3均為膜蛋白質，本研究通過生物信息學分析，將OsV3IP2、OsV3IP3分為不同結構域分別進行外源誘導表達，獲得可溶性肽段，為進一步驗證它們與OsVDAC3的互作提供基礎。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 原核表達載體pET28a、pET-32a、pGEX-6P-1，大腸桿菌表達菌株BL21（DE3）與DH5α均由武陵山區特色資源植物種質保護與利用湖北省重點實驗室提供。

1.1.2 試驗試劑 限制性內切酶QuickCutTM BamH I、QuickCutTM Xho I，T4-DNA連接酶，Ex Taq酶，DL15000和DL2000 DNA Marker均購自Takara公司。DNA凝膠回收和清潔試劑盒均購自Axygen公司。Page RulerTM Prestained Protein Ladder購自Thermo公司。His Tag Mouse Monoclonal Antibody及二抗羊抗鼠購自Abbkine公司。超敏ECL化學發光即用型底物購自武漢博士德生物工程有限公司。引物合成及測序均由昆泰銳生物科技有限公司完成。

1.1.3 試驗儀器 C1000 Touch Thermal Cycler型PCR儀和凝膠成像分析儀，購自美國Bio-RAD公司；752N型紫外可見分光光度計，購自上海精科公司；Centrifuge 5415D、5417R和5810R離心機，購自德國Eppendoff公司；CR22G高速離心機，購自日本Hitachi公司；Soniprep 150型超聲破碎儀，購自日本SANYO公司；半干式碳板轉移電泳槽、DYY-5型穩壓穩流電泳儀和膠片觀察燈，購自北京六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 OsVDAC3及OsV3IP1-3結構分析 利用生物信息學軟件InterProScan軟件（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search）對OsVDAC3及OsV3IP1-3蛋白質的序列和結構進行分析，根據不同的結構域將蛋白質進行拆分，分結構域進行蛋白質誘導及互作驗證。

1.2.2 原核表達載體的構建 根據OsVDAC3和OsV3IP1-3基因序列，設計正向和反向引物，并添加對應的酶切位點。所有引物及序列如表1所示。

采用20 μL體系進行PCR反應：15.3 μL dd H2O， 2 μL 10 ×Ex Taq Buffer，1 μL dNTP（2.5 mmol/L），0.3 μL 引物F（10 mmol/L），0.3 μL 引物R（10 mmol/L），1 μL pET-32a-OsV3IPs質粒DNA，0.1 μL Ex Taq 酶。PCR反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性 30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，重復 34 個循環；72 ℃延伸5 min。PCR擴增反應完成后使用Axy Prep DNA清潔試劑盒對PCR產物進行清潔回收，詳細操作參考試劑盒說明書，并進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用限制性內切酶BamH I和 XhoⅠ雙酶切目的片段和pET-32a空載體，37 ℃酶切3～4 h，使用Axy Prep DNA凝膠回收試劑盒對酶切產物進行切膠回收。用T4連接酶連接雙酶切后的目的基因和pET-32a載體，16 ℃連接過夜并轉化DH5α感受態細胞，涂LB（含Amp+）平板，37 ℃倒置培養過夜。挑取單克隆，采用堿裂解法提取質粒，進行PCR擴增和酶切鑒定，將對應陽性克隆菌液送昆泰銳生物科技有限公司進行序列測定。

1.2.3 融合蛋白誘導表達 將重組質粒和pET-32a空載體轉化BL21（DE3）表達菌株，涂LB（含Amp+）平板，37 ℃倒置培養過夜。分別挑取單克隆于3 mL含Amp+的LB液體培養基中，37 ℃振蕩培養過夜，第二天按1∶100的比例（V/V）接種于5 mL含Amp+的LB液體培養基中，37 ℃，180 r/min 振蕩培養至 OD600 nm為0.6左右，將1 mol/L IPTG稀釋到合適的終濃度。以不加IPTG的重組載體和加IPTG的pGEX-6p-1、pET-32a、pET-28a空載體的BL21菌株作為陰性對照。設置IPTG濃度梯度、誘導時間梯度、誘導溫度梯度來分析最適表達條件。

1.2.4 融合蛋白的SDS-PAGE檢測 將誘導表達的菌液轉入10 mL離心管中，4 ℃，4 000 r/min離心20 min，向菌體沉淀中加入適量的PBS buffer重懸菌體，用移液槍反復吹打混勻。在燒杯中裝入碎冰，將重懸菌體固定其中，進行超聲波破碎（破碎10 s，間歇10 s），觀察液體變澄清即可。4 ℃，8 000 r/min離心20 min，收集蛋白質上清液和沉淀，分別處理。向沉淀中加入適量的蛋白質沉淀變性液，用移液槍吹打混勻，室溫放置約1 h，每隔15 min混勻一次，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，收集上清液，此時的上清液即為沉淀液。將變性蛋白質樣品和適量的SDS-PAGE loading buffer混合均勻后瞬時離心，并在沸水中煮沸10 min變性，放置于冰上冷卻，再次離心，作為上樣產物。60 V恒壓電泳，待指示帶電泳至玻璃板最低端時停止電泳，進行考馬斯亮藍染色或Western檢測。

1.2.5 融合蛋白的Western檢測 半干式轉膜儀80 mA恒流轉膜2.5 h后，加入40 mL蛋白封閉液室溫封閉1.0 h，按1∶5 000的比例（V/V）向封閉液中加入His抗體，4 ℃振蕩過夜，第二天按1∶10 000的比例（V/V）向封閉液中加入二抗羊抗鼠，孵育箱內 25 ℃振蕩孵育1.5 h后進行ECL化學發光檢測。

2 結果與分析

2.1 OsV3IP1-3序列分析

前期試驗發現pET-32a-OsV3IP2以及pET-28a-OsV3IP1、pET-28a-OsV3IP3在體外表達不明顯，所以利用生物信息學軟件對蛋白質的二級結構進行預測，根據InterProScan軟件分析蛋白質的結構。OsV3IP2分為2個部分（圖1），OsV3IP2-1包含第46～76個氨基酸、OsV3IP2-2包含第46～76個氨基酸。OsV3IP3分為4個部分（圖2），OsV3IP3-1包含第315～399個氨基酸、OsV3IP3-2包含第414～623個氨基酸、OsV3IP3-3包含第30～304個氨基酸、OsV3IP3-4包含第22～624個氨基酸。endprint

2.2 原核表達載體的構建

分別以 pET-32a-OsV3IP2-3為模板擴增目的片段，與pET32a連接后構建原核表達載體。從轉化的平板上隨機挑取單克隆進行擴大培養提取質粒，然后對重組質粒進行PCR檢測。結果顯示，OsV3IP1-3的PCR產物與預期的片段大小相符（圖3）。選取大小符合的樣品進行DNA序列測定，序列比對結果表明pET32a重組表達載體構建成功。

2.3 融合蛋白質誘導表達及Western blot檢測

將陽性重組質粒熱激轉化BL21表達菌株，分別加入不同濃度的IPTG后，于不同溫度條件下振蕩培養誘導蛋白質表達，在誘導不同時間段取樣8 mL，從而檢測誘導溫度、誘導IPTG濃度和誘導時間對蛋白質表達的影響。同時，以不加IPTG的pET-32a空載體的BL21菌株作為陰性對照。在誘導溫度為20、30 ℃，IPTG濃度為0.2 mmol/L條件下，pET32a-OsV3IP2-1、pET32a-OsV3IP 2-2、pET32a-OsV3IP 3-1表達的融合蛋白質存在于上清液中，而pET32a-OsV3IP 3-2、pET32a-OsV3IP 3-3表達的融合蛋白質存在于沉淀中（圖4），這一結果進一步通過His抗體的Western Blot分析證明。

3 小結與討論

大腸桿菌表達系統是目前表達外源蛋白質的首選，利用該表達系統表達重組蛋白質有許多優越性，但表達的外源蛋白質容易被宿主蛋白酶攻擊或未能正確折疊形成包涵體，其表達受到了限制[10]。當外源蛋白質在大腸桿菌中表達時，有些蛋白質會在細胞質中形成不溶性的包涵體，顆粒直徑50～500 nm不等[11]，將靶蛋白質融合在某些易于表達和純化的“融合標簽”的N末端或C末端可提高蛋白質的高效可溶性表達。本試驗利用生物信息學軟件對蛋白質的二級結構進行預測，根據InterProScan軟件分析蛋白質的結構，將OsV3IP2、OsV3IP23分別分成2個和4個部分分別進行體外表達，在優化條件下獲得了可溶性目的蛋白質OsV3IP2-1、OsV3IP 2-2、OsV3IP 3-1，這些結果為體外進一步驗證OsVDAC3與OsV3IP2、OsV3IP3的互作奠定了基礎。

參考文獻：

[1] SHOSHAN-BARMATZ V，BEN-HAIL D. VDAC，a multi-functional mitochondrial protein as a pharmacologicaltarget[J].Mitochondrion，2012，12（1）：24-34.

[2] LEANZA L，ZORATTI M，GULBINS E，et al. Mitochondrial ion channels as oncological targets[J].Oncogene，2014，33：5569-5581.

[3] DE PINTO V，GUARINO F，GUARNERA A，et al. Characterization of human VDAC isoforms：A peculiar function for VDAC3[J].Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics，2010，1797（6）：1268-1275.

[4] TATEDA C，WATANABE K，KUSANO T，et al. Molecular and genetic characterization of the gene family encoding the voltage-dependent anion channel in Arabidopsis[J].Journal of Experimental Botany，2011，62（14）：4773-4785.

[5] XU X，TAN Y P，CHENG G，et al. Genomic survey and gene expression analysis of the VDAC gene family in rice[J].Genetics and Molecular Research，2014，14（4）：15683-15696.

[6] 胡 穎，王春臺，覃永華.水稻基因OsVDAC3的逆境功能分析[J].華中農業大學學報，2015，34（6）：1-6.

[7] 鐘英健.水稻4個OsVDAC蛋白的亞細胞定位[D].武漢：中南民族大學，2015.

[8] 熊 杰.3個水稻OsVDAC基因的原核和真核表達研究[D].武漢：中南民族大學，2012.

[9] 劉 洋.OsVDAC3和OsVDAC5蛋白的原核表達及表達模式的初步分析[D].武漢：中南民族大學，2014.

[10] 蘇 鵬，龔國利.優化大腸桿菌表達外源蛋白的研究進展[J].生物技術通報，2017，33（2）：16-23.

[11] RUEDA F，CANO-GARRIDO O，MAMAT U，et al. Production of functional inclusion bodies in endotoxin-free Escherichia coli[J].Applied Microbiology & Biotechnology，2014，98（22）：9229-9238.endprint