駝峰藤組織培養及快速繁殖

侯俊+王彩云+張翔宇+阮培均

摘要：以駝峰藤（Merrillanthus hainanensis）帶芽莖段為外植體，研究不同消毒方法及植物生長調節劑對其離體培養及植株再生的影響，建立了駝峰藤離體快繁技術體系。結果表明，帶芽莖段的最佳消毒滅菌方法為75%乙醇浸泡20 s，0.1% HgCl2浸泡10 min；腋芽誘導的最適宜培養基為MS+2.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA+0.10 mg/L GA3，誘導率可達81.11%；適宜腋芽增殖的培養基為MS+3.50 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA，增殖系數可達6.24；最佳生根培養基為1/2MS+0.30 mg/L NAA，生根率為84.44%，該結果為駝峰藤的快繁提供了一條新途徑。

關鍵詞：駝峰藤（Merrillanthus hainanensis）；帶芽莖段；組織培養；快速繁殖

中圖分類號：Q813.1+2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）17-3345-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.17.040

Tissue Culture and Rapid Propagation of Merrillanthus hainanensis

HOU Jun1， WANG Cai-yun2， ZHANG Xiang-yu2， RUAN Pei-jun2

（1.Poverty Alleviation and Development Office of Dafang County，Bijie 551700，Guizhou，China；

2.Bijie Institute of Traditional Chinese Medicine，Bijie 551700，Guizhou，China）

Abstract： In order to establish the tissue culture and rapid propagation system of Merrillanthus hainanensis，the effects of different disinfection method and plant growth regulators on plant regeneration in vitro were studied using stems with axillary buds as explants. The results showed that the better disinfection method for stems with axillary buds was to use 75% alcohol immersion 20 s，then use 0.1% HgCl2 immersion 10 min；the fittest medium for germination of stem axillary bud was MS+2.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA+0.10 mg/L GA3，with a 81.11% germination rate of axillary bud. The best medium for shoot multiplication was MS+3.50 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA，the multiplication coefficient could reach 6.24. The best rooting medium was 1/2MS+0.30 mg/L NAA，with a 84.44% rooting rate. The research supplied a new way for rapid propagation of Merrillanthus hainanensis.

Key words： Merrillanthus hainanensis；stems with axillary buds；tissue culture；rapid propagation

駝峰藤（Merrillanthus hainanensis）是蘿藦科駝峰藤屬木質藤本植物，為國家二級保護植物，中國特有物種[1-3]，生長于低海拔至中海拔山地林谷中，主要分布于高要、保亭、萬寧和白沙等地[4-6]，具有一定的觀賞和藥用價值[7]。駝峰藤作為一種稀少的藤本植物，保護其種群、開發其價值意義深遠。目前，國內關于駝峰藤的研究甚少，主要集中于形態學研究及野生資源調查，有關駝峰藤的組織培養及獲得再生植株的研究鮮見報道。本試驗以駝峰藤的莖段為試驗材料，研究了外植體的消毒、初代培養、繼代增殖、生根等一系列過程，獲得了完整的駝峰藤組培苗，為駝峰藤的物種保存和快速繁殖提供理論基礎和實踐依據，也為駝峰藤的開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

駝峰藤莖段采自海南大學農學院熱帶珍稀植物保護與利用實驗室種植的無病蟲害植株上。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒 將采集的莖段去除葉片，用自來水沖洗10～15 min，然后在適量的洗潔精水中浸泡15 min，用自來水沖洗干凈后置于超凈工作臺中，用75%的乙醇及0.1%HgCl2消毒滅菌，設置不同時間梯度消毒處理，如表1所示。消毒過程中用鑷子不斷攪動，無菌水沖洗6～7遍，用無菌濾紙吸干莖段表面的水分，再用無菌刀片切掉兩端后，將帶芽莖段接種到初代培養基中，15 d后統計污染率、死亡率及成活率。為防止交叉污染，每個組培瓶接種1個外植體，每個組合接種30瓶，重復3次。污染率=（污染外植體數/接種外植體數）×100%；死亡率=（死亡不污染外植體數/接種外植體數）×100%；成活率=（萌發不污染外植體數/接種外植體數）×100%。endprint

1.2.2 腋芽誘導培養 將消毒好的腋芽莖段接種在含6-BA（1.00、2.00、3.00 mg/L）、NAA（0.05、0.10、0.15 mg/L）和GA3（0、0.05、0.10 mg/L）的MS培養基中進行腋芽誘導（表2），暗培養5 d后轉入光照條件下培養，30 d后統計腋芽誘導率及腋芽生長情況，每個組合接種10瓶，每瓶接種3個外植體，重復3次。腋芽誘導率=（萌芽的外植體數/接種外植體總數）×100%。

1.2.3 繼代增殖培養 將初代培養的腋芽切下后轉接到含6-BA（1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00 mg/L）和NAA（0.15 mg/L）的繼代增殖培養基中（表3），在光照條件下培養35 d后統計增殖系數。每個處理接種30瓶，每瓶接種1個不定芽，重復3次。增殖系數=增殖后獲得的芽數/接種時的芽數。

1.2.4 生根培養 切取生長健壯、長勢一致（高2～3 cm）的芽苗接種在分別含NAA（0、0.10、0.30、0.50 mg/L）的1/2MS、MS培養基中進行生根培養（表4），光照培養下30 d后統計生根率、生根數及根長。每個處理接種30瓶，每瓶接種1個芽，重復3次。生根率=（生根的芽總數/接種芽總數）×100%。

1.2.5 培養條件 以MS為基本培養基，含蔗糖30 g/L（生根培養基蔗糖含量為20 g/L），卡拉膠7 g/L，pH為5.8～6.0，121 ℃高溫滅菌20 min。光照度 1 500～2 000 lx，光照時間為10～12 h/d，培養溫度24～26 ℃。

1.2.6 數據統計分析 數據統計分析采用Excel及IBM SPSS Statistics 20軟件進行。

2 結果與分析

2.1 消毒處理

如表1所示，消毒時間過短污染率較高，消毒時間較長外植體死亡率較高，不利于腋芽的萌發。當乙醇消毒時間為20 s時，隨著HgCl2消毒時間的增長，污染率逐漸下降，但莖段死亡數量逐漸增加；當 HgCl2消毒時間10 min時，隨著乙醇消毒時間的延長，莖段死亡率逐漸增加，污染率下降。經分析發現，A6的平均成活率與其他處理差異極顯著，且平均污染率最低，平均成活率最高，消毒效果最好。因此，最適合駝峰藤莖段的滅菌消毒方法為75%乙醇浸泡20 s，0.1%HgCl2浸泡10 min。

2.2 初代培養

將消毒好的駝峰藤莖段接種在腋芽誘導培養基中（表2），光照條件下培養15 d左右，腋芽開始萌發（圖1A、C），繼續培養15 d后腋芽高度可達2 cm左右。由表2可知，B5組誘導產生的不定芽莖較粗壯，葉色濃綠，形態與實生苗相似，長勢良好（圖1B），且腋芽誘導率與其他處理差異達極顯著水平，不定芽誘導率為81.11%，誘導效果最好。因此，適合駝峰藤莖段腋芽萌發的最佳培養基為MS+2.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA+0.10 mg/L GA3。

2.3 繼代增殖培養

將初代培養的腋芽切下接種到繼代增殖培養基中，由表3可知，當NAA濃度不變時，6-BA濃度在1.50～3.50 mg/L范圍內，隨著6-BA濃度的不斷升高，芽的增殖系數逐漸升高，腋芽逐漸變細、顏色逐漸變淺，當6-BA濃度達2.50 mg/L時，腋芽顏色深綠，莖桿較粗（圖2A）；當6-BA濃度達3.50 mg/L時，增殖系數最大，為6.24，且與其他處理的增殖系數差異達極顯著水平，此時腋芽顏色偏黃，莖桿較細（圖2B）；當6-BA濃度達4.00 mg/L時，增殖系數開始下降。

2.4 生根培養

將增殖培養中2～3 cm的腋芽接種到生根培養基中進行根系誘導（表4），15 d后基部有根系產生，繼續培養15 d后根系較長。由表4可知，在未加植物生長調節劑的D1組中，腋芽的生根率為0，在培養基中添加0.10 mg/L NAA時，開始有根系長出，但根系不發達，表現為根短而少；同等植物生長調節劑條件下，1/2MS培養基的生根效果高于MS培養基的生根效果；隨著NAA濃度的升高，根系越長，其中D4處理駝峰藤平均根長最長，為2.49 cm，與其他處理差異達到極顯著水平；在1/2MS培養基中加入0.30 mg/L NAA后，生根率和生根數整體增加，生根的組培苗長勢最好。因此，適合駝峰藤腋芽生根的最佳培養基為1/2MS+0.30 mg/L NAA，其生根率最高，為84.44%，平均生根數為5.25條，與其他生根處理差異極顯著，此時的平均根長為1.87 cm。

3 結論與討論

外植體的選擇在植物離體快繁體系的建立中至關重要[8]，而外植體的消毒及無菌材料的獲得是植物組織培養成功的前提[9]。本研究預試驗中發現第四節以下的莖段消毒非常困難，其污染率非常高，可能是在環境中生長的時間較長，且老莖表面較粗糙，造成消毒困難。因此，在正式試驗階段，選用的莖段均從長勢良好的植株上切下，并選用前四節作為外植體，在很大程度上減輕了消毒的難度，但部分莖段在培養20 d以后，仍會出現污染現象，可能是外植體本身含有內生菌的緣故。前人研究表明，多年生木本植物和生長在高溫多雨的亞熱帶、熱帶植株容易表現內源細菌污染，且內生菌污染在前期會導致組培苗增殖率低、生長緩慢，更會導致組培苗死亡及后期移栽困難[10-13]。本研究發現駝峰藤木質化程度較高的莖段帶有內生菌，因此盡量選擇半木質化的莖段作為外植體，在后期繼代過程中發現有污染的腋芽，應及時剔除，以防影響其他無菌苗，至于內生菌的抑制及清除還需在后續的抗生素選擇試驗中進一步研究。

在植物組織培養中，內源性激素形成速度慢，一般無法滿足植株生長需求，因此植物生長調節劑的使用是誘導植物分化芽和根的關鍵[14]。本試驗中，以MS為基礎培養基，添加2.00 mg/L 6-BA、0.10 mg/L NAA、0.10 mg/L GA3后駝峰藤腋芽的誘導率最高，且此時的腋芽粗壯，葉色濃綠，形態與實生苗相似，長勢良好，這與吳玲利等[15]對白木通（Akebia trifoliata）的快速繁殖研究結果類似。endprint

繼代增殖是組織培養的關鍵，找到適宜的增殖培養基配方，才能達到組培快速繁殖的目的[16]。在腋芽繼代增殖過程中，6-BA和NAA組合是最常用的方法[17，18]。在駝峰藤腋芽繼代增殖培養中發現，添加6-BA和NAA能促進腋芽增殖，且6-BA對腋芽增殖誘導的效果明顯，但使用過程中需要控制好濃度，過高濃度會抑制小芽生長，并導致腋芽增殖率的降低及玻璃化苗的出現，這與遆衛國等[19]在鹽節木（Halocnemum strobilaceum）中的研究結果相符。

在生根培養中發現，葉片較多、幼嫩、健壯的腋芽是生根的基礎，培養時間太久的芽苗木質化程度高，不利于生根培養，這與譚曉風等[20]在油桐（Vernicia fordii）試管苗生根的結果相似。本研究選用1/2MS、MS兩種營養成分及濃度差異較大的基本培養基，發現駝峰藤組培苗在1/2MS培養基中的生根效果優于MS培養基，說明降低無機鹽的濃度更有利于根的誘導，這與付姝穎等[21]在藥用植物猴耳環（Pithecellobium clypearia）生根試驗中的結果相一致。

適宜的生長素水平和種類可以促進植株根系的良好分化，而不同植物對生長素的濃度和種類需求不同。在本試驗中，NAA對駝峰藤叢生芽根系分化的誘導效果較好，最佳濃度為0.30～0.50 mg/L，能快速分化根系，且形成的根系多且粗壯，這與黃賽等[22]在土田七（Stahlianthus involucratus）中的研究結果相符；但NAA濃度過高生根率反而降低，這與洪震等[23]在秀麗野海棠（Bredia amoena）試管苗生根過程中的研究結果相一致。

本研究首次從莖段無菌材料的獲得、腋芽誘導、繼代增殖及生根培養整個過程成功建立了駝峰藤帶芽莖段的再生體系，為駝峰藤的工廠化育苗及物種保護打下基礎。

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