部分桑樹品種的SSR遺傳多樣性分析

楚渠+孟剛+彭云武

摘要：利用SSR（Simple sequence repeat）技術對17個桑樹（Morus alba L.）種質資源的遺傳多樣性進行了分析。結果表明，28對SSR引物擴增產物在17份桑樹品種中均存在多態性；17份桑樹品種間的遺傳一致度變異范圍為0.550 9～0.905 7，平均遺傳一致度為0.728 3，大十與康利1號的遺傳一致度為0.905 7。利用桑樹品種間的遺傳距離進行聚類分析，可將17個桑樹品種分成4個大類。這一結果與《中國桑樹品種志》上的形態學分類結果一致。

關鍵詞：桑樹（Morus alba L.）；品種；遺傳多樣性

中圖分類號：S888.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）17-3292-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.17.026

Analyses on Genetic Diversity of Some Mulberry Varieties

CHU Qu， MENG Gang， PENG Yun-wu

（Key Sericulture Laboratory of Shaanxi Province， Ankang Univetsity， Ankang 725000， Shaanxi， China）

Abstract： Using SSR（Simple sequence repeat） molecular technique，the genetic diversity of seventeen mulberry germplasm resources were analyzed. The results showed that，twenty-eight pairs of SSR primers amplified products were found polymorphic in seventeen mulberry varieties；Seventeen mulberry varieties between the consistent degree of genetic variation was 0.550 9～0.905 7，the average genetic identity was 0.728 3，the genetic identity of Dashi and Kangli No.1 was 0.905 7. Cluster analysis based on genetic distance among mulberry varieties was conducted，seventeen mulberry varieties can be divided into four categories. The result is consistent with the morphological classification of Journal of China Mulberry Varieties.

Key words： mulberry（Morus alba L.）； variety； genetic diversity

桑樹是多年生落葉植物，據統計，1952-1986年，中國科技工作者共發現和收集桑樹品種材料 1 100余份[1]。陜西省蠶桑重點實驗室保存了野生桑、育成桑等500余份桑樹品種。在傳統形態分類學的基礎上，應用分子標記技術對桑樹品種深入開展分子分類學和遺傳多樣性研究是成熟且為學界認可的分類學新途徑[2-4]。為此，試驗利用安康學院收集保存的桑樹資源材料，包括野生桑桑樹品種、誘變育成桑樹品種、地方選育桑樹品種，研究桑樹品種間的遺傳多樣性，以期為針對一些核心桑樹品種資源深入開展基礎研究和開發利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取安康學院收集保存的17個桑樹品種作為試驗材料，包括3份野生桑品種，14份育成桑樹品種，其中果桑品種有大十、桂花蜜、長穗桑、康利1號和葫蘆桑。具體信息見表1。

1.2 主要引物

試驗選用的引物信息見表2。

1.3 試驗方法

1）基因組 DNA的提取與檢測。取各供試材料的中部葉片（每個桑樹品種材料隨機取8個單株的成熟葉片各3片混合）置于已經編號的保鮮袋中并迅速帶回實驗室，采取改良的CTAB法對其基因組DNA進行提取。室溫靜置待抽提DNA干燥之后，加入50 μL TE緩沖液溶解，取2～3 μL經瓊脂糖凝膠電泳檢測合格之后，樣品置于-20 ℃保存備用。

2）PCR反應。PCR反應為20 μL體系，體系中依次加入ddH2O 14.8 μL，dNTP 0.4 μL，10×PCR Buffer 2 μL， 正向引物 0.3 μL（20 μmol/L），反向引物0.3 μL（20 μmol/L），DNA模板2 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL后混勻。

SSR PCR擴增程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃復性35 s，72 ℃延伸40 s，共 35個循環；72 ℃延伸3 min后4 ℃終止反應。

3）聚丙烯酰胺凝膠電泳。取2 μL SSR PCR產物混合上樣緩沖液，94 ℃變性10 min后用于SDS-PAGE電泳。聚丙烯凝膠濃度為6%，垂直電泳條件為220 V預電泳10 min后，125 V電泳約3.5 h。銀染后觀察記錄染色條帶。

1.4 數據分析

根據SSR-PCR產物的SDS-PAGE電泳圖，凝膠上某個相同遷移率位置上有DNA條帶記為1，無DNA條帶記為0，形成SSR的表型數據矩陣，使用POPGENE32、NTSYS軟件進行統計分析。endprint

用POPGENE 32計算多態位點百分率P （percent of polymorphic loci）和有效等位基因數Ne （effective number of alleles per loci）。

用Neis（1972）的遺傳一致度I（genetic identity）和遺傳距離D（genetic distance）來衡量各種群之間的遺傳分化大小?；谶z傳距離，采用類平均聚類法（UPGMA）對各種群進行聚類分析，構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 17個桑樹品種的遺傳多樣性和遺傳變異

利用已開發的引物用于17份桑品種遺傳分析，從表3可以看出，28對引物共擴增出清晰譜帶265條，不同引物的擴增條帶數從3～19條不等，平均每個引物的擴增帶數為9.5條，本次分析中，引物S-p40擴增條帶數最多，為19條，引物S-p29擴增條帶數最少，為3條。平均多態性百分率為100%。

2.2 17個桑樹品種的遺傳距離和遺傳相似系數

利用軟件結合SSR-PCR和SDS-PAGE電泳，對17份桑樹品種間的遺傳一致度和遺傳距離進行了分析，結果（表4）表明，17份桑樹品種間的遺傳一致度變異范圍為0.550 9～0.905 7，平均遺傳一致度為0.728 3。大十與康利1號的遺傳一致度為0.905 7，桐鄉青與荷葉白的遺傳一致度為0.894 3。

2.3 17個桑樹品種的聚類分析

利用桑樹品種間的遺傳距離進行聚類分析（圖1），可將17個桑樹品種分成4個大類。其中3個野生桑樹品種各自獨聚一類（3-葫蘆桑、10-長穗桑、15-巖桑），14個育成桑樹品種聚為一類。果桑中的大十與康利1號的遺傳距離最近，為0.099 1，在形態學上它們的葉片外形和枝條皮色、桑芽形狀都相似，差異在于大十桑椹長度比康利1號長、大十桑椹成熟時間比康利1號早、大十桑椹糖度比康利1號高、康利1號桑椹略帶酸味。

3 小結

本研究利用SSR分子標記技術對安康學院收集保存的桑樹地方品種、野生桑品種和誘變育成品種的遺傳多樣性進行了分析，并對它們之間的親緣關系進行了探討。從結果看，17個桑樹品種間的遺傳一致度變異范圍為0.550 9～0.905 7，平均遺傳一致度為0.728 3，桑樹地方品種間的遺傳基礎比較狹窄，親緣關系比較接近。彭波等[5]應用SSR引物分析了172個桑樹品種（系）的遺傳多樣性，結果是遺傳相似性系數在0.72～1.00之間，認為遺傳基礎比較狹窄。楚渠等[6]應用28對SSR引物分析了55份陜西地方桑樹種質資源的遺傳多樣性，結果是55份桑樹品種間的遺傳相似系數變異范圍為0.639 8～0.965 5，認為桑樹品種的親緣關系與地理分布不存在關聯。本研究結果表明，在前期開發的引物能有效地擴增出多態性條帶，并實現對桑樹品種的遺傳關系分析，同時在此基礎上分析了桑樹品種親緣關系，其結果與此前的研究報道一致，進一步說明了研究方法的可行和研究結果的可靠性。本研究將為深入探討不同桑樹品種之間的遺傳進化關系提供理論基礎，同時也在桑資源開發利用過程中應對不同需求而面臨的桑樹品種選擇等方面具有理論指導意義。

參考文獻：

[1] 中國農業科學院蠶業研究所.桑樹品種資源目錄[M].北京：農業出版社，1986.

[2] TORRES T T，BRONDANI R P V，GARCIA J E，et al. Isolation and characterization of six novel microsatellite markers for mulberry（Morus indica）[J].Molecular Ecology Resoures，2010， 4（3）：477-479.

[3] ZHAO W G，MIAO X X，JIA S H，et al. Isolation and characterization of microsatellite loci from the mulberry，Morus L.[J].Plant Science，2005，168（2）：519-525.

[4] 楚 渠，孟 剛.桑樹SSR引物的開發及其多態性分析[J].湖北農業科學，2016，55（11）：2824-2828，2884.

[5] 彭 波，胡興明，鄧 文，等.桑樹種質資源SSR標記的遺傳多樣性分析[J].湖北農業科學，2010，49（4）：779-784.

[6] 楚 渠，彭云武.利用SSR標記對陜西地方桑樹品種的遺傳多樣性分析[J].陜西農業科學，2015，61（6）：17-20.endprint