利用花藥培養快速選育廣親和水稻材料

査中萍+杜雪樹+萬丙良+殷得所+李進波+夏明元+戚華雄

摘要：以秈粳交品種甬優4949為材料進行花藥培養，建立了秈粳交DH群體，并對豐產性較好的DH系進行廣親和基因S5n的PCR檢測，獲得了含有廣親和基因S5n的DH系材料。

關鍵詞：水稻（Oryza sativa L.）；花藥培養；秈粳交；廣親和

中圖分類號：S511 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）17-3213-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.17.004

Rapid Breeding of Wide Compatibility Rice Materials by Anther Culture

ZHA Zhong-ping， DU Xue-shu， WAN Bing-liang， YIN De-suo， LI Jin-bo， XIA Ming-yuan， QI Hua-xiong

（Food Crops Institute， Hubei Academy of Agricultural Sciences/Hubei Key Laboratory of Food Crop Germplasm and Genetic Improvement， Wuhan 430064， China）

Abstract： DH population was got by anther culture from Yongyou 4949， which is a indica-japonica hybrid rice. The wide compatibility gene S5n were detected by PCR in the DH lines with high yield potential and the DH lines with wide compatibility gene S5n were obtained.

Key words： rice （Oryza sativa L.）； anther culture； indica-japonica hybrid； wide compatibility

水稻（Oryza sativa L.）是世界上重要的糧食作物之一，在其長期的栽培馴化過程中形成了秈、粳2個亞種[1-5]，亞種間的雜種一代具有強大的雜種優勢，水稻秈、粳亞種間雜種優勢的利用是進一步提高水稻單產的重要途徑之一。但秈、粳亞種間雜種一般結實率偏低、子粒充實度差，這些問題制約了亞種間雜交稻的利用[6]。水稻廣親和基因S5n可克服秈粳生殖障礙，與秈稻或粳稻亞種雜交能產生正?？捎暮蟠鶾7]。培育和利用廣親和水稻品種是促進水稻秈粳雜種優勢、進一步提高水稻產量的當務之急。但已知的廣親和品種多為農藝性狀欠佳的農家品種，不能直接作為親本使用；而常規育種方法選育優良性狀的廣親和品種需要雜交、回交、轉育，耗時冗長，育種周期長。近年來育種家們育成了甬優12、浙優18、春優84[8-11]等一批綜合性狀優良的秈粳亞種間組合，為進一步利用秈粳間雜種優勢奠定了良好的基礎。

水稻花藥培養可以快速獲得純系、提高選擇效率、有效縮短育種周期。試驗以目前生產上優良的秈粳組合甬優4949為材料，利用水稻花藥培養方法獲得純合DH（雙單倍體）系，并對DH系進行廣親和基因S5n的PCR檢測，為快速選育廣親和水稻材料提供了一條有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

甬優4949是由寧波市種子有限公司和武漢佳禾生物科技有限責任公司培育的三系秈粳雜交中稻品種。2015年通過湖北省農作物品種審定委員會審定。本試驗所用甬優4949由武漢佳禾生物科技有限責任公司提供。

1.2 方法

1.2.1 水稻材料種植 2015年春季在武漢分期播種，大田移栽，以獲得足夠發育時期適宜的花藥。具體分期播種和移栽時間見表1。

1.2.2 花藥取材 2015年7月起，分期播種的甬優4949依次進入孕穗期。于晴天的下午取單核靠邊期的幼穗，為保證幼穗新鮮，取樣時幼穗留2節及2～3片葉片，放在盛有清水的桶中。取好的幼穗在室內顯微鏡下觀察花粉母細胞發育時期。

1.2.3 預處理 田間取回的幼穗在實驗室里重新修剪，保留幼穗2葉1節，75%乙醇表面消毒后，用保鮮膜包好幼穗，放在4 ℃冰箱中預處理7～10 d。

1.2.4 誘導培養 預處理結束后，剝去多余葉片和葉鞘，留取發育適宜的帶枝小穗，裝入無菌燒杯中，先用75%乙醇表面消毒30 s，再用0.1% HgCl2溶液浸泡10 min左右，無菌水沖洗3～4次，每次1 min，最后用無菌濾紙吸干小穗水分。在超凈工作臺上用剪穎抖藥法將花藥接種至誘導愈傷培養基上，誘導培養基為設置不同基本培養基和不同碳源4種培養基，分別為①N6+2，4-D 2 mg/L+KT 1 mg/L+NAA 3 mg/L+蔗糖50 g/L；②N6+2，4-D 2 mg/L+KT 1 mg/L+NAA 3 mg/L+麥芽糖50 g/L；③SK3+2，4-D 2 mg/L+KT 1 mg/L+NAA 3 mg/L+蔗糖50 g/L；④SK3+2，4-D 2 mg/L+KT 1 mg/L+NAA 3 mg/L+麥芽糖50 g/L。每個三角瓶約接種80～100個花藥，25 ℃左右暗培養至愈傷組織直徑達2 mm左右。

1.2.5 分化培養及生根 將直徑2 mm以上的愈傷組織在超凈工作臺上轉移到分化培養基，分化培養基為實驗室水稻通用分化培養基（MS+KT 2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L）。25 ℃、1 000～1 500 lx、10～12 h/d光照培養直至綠苗分化。當綠苗長到5 cm以上時，在超凈工作臺上將綠苗轉移到生根培養基上進行生根。生根培養基為 1/2MS+NAA 0.5 mg/L+活性炭0.8 g/L+蔗糖20 g/L。endprint

1.2.6 純合DH系的獲得 將根系發育良好的再生植株經過煉苗后移植到大田，每個愈傷組織來源的植株單株收種，每個單株獲得的種子次年種成株系，通過田間農藝性狀調查，選取田間農藝性狀純合株系10～30個。結合室內考種，選取農藝性狀優良、結實率高、豐產性好的DH系5～15個。

1.2.7 廣親和水稻材料的獲得 對農藝性狀優良、豐產性好的優良純合DH系進行廣親和基因S5n的PCR檢測。廣親和基因S5n檢測的正向引物（F1）序列為5′-ATCAACCCATTTCCTTTCCT-3′，反向引物（R1）序列為5′-ATACGCTCGATCGGATTAAC-3′，含有廣親和基因S5n的DH系能擴增出441 bp的片段，而不含有廣親和基因S5n的品種擴增出的片段為577 bp。PCR擴增體系為10×含Mg2+的PCR緩沖液1.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.2 μL，Taq DNA聚合酶 1 U，DH系基因組DNA模板1 μL，10 μmol/L的正向引物F1 0.2 μL，10 μmol/L的反向引物R1 0.2 μL，ddH2O補充體積至15 μL。PCR反應條件為94 ℃預變性4 min；94 ℃變性 40 s，50 ℃復性30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環；然后72 ℃延伸5 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物帶型，紫外凝膠成像系統照像。

2 結果與分析

2.1 甬優4949花藥取材的適宜時期

通過顯微鏡觀察發現，甬優4949品種花粉母細胞發育處于單核靠邊期的幼穗葉枕距一般在6～10 cm，此時幼穗的穎殼寬度已接近成熟的大小，穎殼呈現淡綠色，雄蕊伸長達穎殼的1/3～1/2。取材時葉枕距隨溫度的變化略有不同，溫度越高，葉枕距越短；溫度越低，葉枕距越長。

2.2 甬優4949花藥培養再生體系的建立

4種誘導培養基的誘導率分別為15.04%、7.30%、10.77%和4.71%。表明對于甬優4949，N6比SK3基本培養基的誘導率高，蔗糖比麥芽糖的誘導率高。利用實驗室水稻通用分化培養基，甬優4949共獲得綠苗2 424株，平均綠苗分化率為13.95%。

2.3 純合DH系的獲得

2015年冬季將根系發育良好的再生植株經過煉苗后帶到海南大田移植，每個愈傷組織來源的植株單株收種。每個單株獲得的種子2016年種成株系，通過田間農藝性狀調查，選取田間農藝性狀純合株系22個。結合室內考種，選取農藝性狀優良、結實率高、豐產性好的DH系12個，DH系編號及室內考種結果見表2。

2.4 廣親和水稻材料的獲得

對上述12個農藝性狀優良、豐產性好的優良純合DH系進行廣親和基因S5n的PCR檢測，檢測結果見圖1。由圖1可知，2016DH283、2016DH420、2016DH504、2016DH760、2016DH913共5個DH系能擴增出441 bp的目標片段，說明這5個株系均含有廣親和基因S5n。

3 討論

廣親和基因S5n是能夠恢復秈粳雜交雜種育性的基因，利用常規育種獲得親和基因耗時冗長。在水稻細胞工程育種中，水稻花藥培養作為一項高效、實用、成熟的育種新技術具有能有效縮短育種周期、擴大變異范圍、提高選擇效率、加速有效性狀轉移等優勢，在水稻新品種選育、三系提純改良、種質資源創新、秈粳遠緣雜種優勢利用、三系與兩系雜交稻選育及水稻基因工程育種等方面應用越來越廣泛。同時，通過花藥培養建立的DH群體屬于永久的遺傳資源，有著廣泛的用途，水稻中己有不少DH群體，但很少有秈粳交DH群體的建立。而秈粳間雜種優勢強，有效利用其雜種優勢已成為培育超級稻的主要方向[12]。本研究中，利用目前生產上推廣應用的秈粳交品種甬優4949為材料，不僅建立了對秈粳雜交育種和研究具有較大應用潛力的DH群體，而且通過分子標記技術選育了含有廣親和基因的純合DH系。本研究不僅大大縮短了選育廣親和水稻材料的育種年限，更為促進秈粳交雜種優勢利用提供了豐富的育種資源。

參考文獻：

[1] NORMILE D. Yangtze seen as earliest rice site[J].Science，1997，275（5298）：309.

[2] MO RISHIMA H，OKA H I. Phylogenetic differentiation of cultivated rice，XXII. Numerable evaluation of the Indica-Japonica differentiation[J].Japanese Journal of Breeding，1981，31（4）：402-413.

[3] GLASZMANN J C. Isozymes and classification of Asian rice varieties[J].Theoretical and Applied Genetics，1987，74（1）：21-30.

[4] WANG Z Y，TANKSLEY S D. Restriction fragment length polymorphism in Oryza sativa L.[J].Genome，1989，32（6）：1113-1118.

[5] BLAIR M W，PANAUD O，MCCOUCH S R. Inter-simple sequence repeat（ISSR） amplification for analysis of microsatellite motif frequency and fingerprinting in rice（Oryza sativa L.）[J].Theoretical and Applied Genetics，1999，98（5）：780-792.

[6] 蔡星星，劉 晶，仇吟秋，等.秈稻93-11和粳稻日本晴DNA插入缺失差異片段揭示的水稻秈-粳分化[J].復旦學報（自然科學版），2006，45（3）：309-315.

[7] IKEHASHI H，ARAKI H. Varietal screening of compatibility types revealed in F1 fertility of distant cross in rice[J].Japanese Journal of Breeding，1984，34（3）：304-313.

[8] 熊 渠，王文豐，李愛武，等.秈粳雜交稻新組合甬優4949 在湖北孝感種植表現及栽培技術[J].雜交水稻，2016，31（5）：41-43.

[9] 王林友，王建軍，張禮霞，等.雜交稻浙優18特征特性及栽培技術[J].浙江農業科學，2013（4）：364-366.

[10] SONG X W，LIN J R，WU M G，et al. The Breeding of new indica-japonica intersubspecific hybrid rice combination Chunyou 84[J].Agricultural Science & Technology，2015，16（6）：1103-1105，1114.

[11] 戚華雄，査中萍.水稻品種秈粳屬性的鑒定方法研究[J].湖北農業科學，2015，24（12）：6130-6133.

[12] 吳建梅，杜荔輝，吳為人，等.水稻秈粳交秈型不育系的雜種優勢利用[J].福建農林大學學報（自然科學版），2012，41（1）：1-6.endprint