鹽堿土壤轉Bt基因棉花外源蛋白表達量時空變化及對抗蟲性的影響

雒珺瑜,崔金杰,張 帥,朱香鎮,呂麗敏,王春義,張利娟,王 麗,李春花,周治國

1 中國農業科學院棉花研究所,棉花生物學國家重點實驗室,安陽 455000 2 南京農業大學農學院,農業部南方作物生理生態重點開放實驗室,南京 210095

鹽堿土壤轉Bt基因棉花外源蛋白表達量時空變化及對抗蟲性的影響

雒珺瑜1,崔金杰1,張 帥1,朱香鎮1,呂麗敏1,王春義1,張利娟1,王 麗1,李春花1,周治國2,*

1 中國農業科學院棉花研究所,棉花生物學國家重點實驗室,安陽 455000 2 南京農業大學農學院,農業部南方作物生理生態重點開放實驗室,南京 210095

鹽堿地是潛在的可利用耕地資源,但土壤鹽堿化嚴重制約了農業生產的可持續發展?；诿藁C械化程度低、勞動力成本和生產資料投入劇增、比較效益下降和實施糧食生產安全戰略等因素影響,我國長江流域和黃河流域棉花面積銳減,種植區域向內陸鹽堿旱地或濱海鹽堿地轉移,但目前針對鹽堿地轉Bt基因棉種植可能帶來的生態安全性問題研究甚少,正成為國內外研究的焦點和熱點。伴隨著棉花向鹽堿地大面積轉移種植趨勢,檢測鹽脅迫是否影響轉基因抗蟲棉抗蟲性,明確其影響程度,直接關系到轉基因抗蟲棉種植的安全性,也是目前抗蟲棉擴大生產中迫切需要解決的問題。以非轉基因棉花為對照,分別在低鹽、中鹽和高鹽土壤種植的棉花的苗期、蕾期和花鈴期采樣,室內測定了轉Bt基因棉花葉片對棉鈴蟲幼蟲校正死亡率和外源蛋白表達量。研究結果發現鹽分脅迫下轉Bt基因棉花苗期葉片對棉鈴蟲幼蟲校正死亡率下降了9.22%—47.46%,蕾期下降了31.61%—45.42%,花鈴期下降了3.59%—18.52%；土壤鹽分顯著降低了轉Bt基因棉花葉片中外源蛋白的表達量,苗期功能葉外源蛋白表達量下降了7.66%—29.86%；蕾期下降了3.77%—36.85%；花鈴期下降了18.13%—41.02%；相關性分析表明,鹽分脅迫條件下轉Bt基因棉花葉片中外源蛋白表達量與其對棉鈴蟲抗性程度存在正相關關系。結果表明,鹽堿土壤顯著降低了轉Bt基因棉花葉片外源殺蟲蛋白表達量,從而導致轉Bt基因棉花葉片對棉鈴蟲的抗蟲性下降。研究土壤鹽分對轉Bt基因棉花對棉鈴蟲的影響及其作用機制,可為建立鹽堿地轉Bt基因棉花田害蟲綜合防控技術體系、轉Bt基因棉花環境安全評價及轉Bt基因棉安全管理提供依據。

土壤鹽分；轉Bt基因棉花；外源蛋白表達量；抗蟲性；時空變化

Abstract： Saline-alkali land is a potentially exploitable reserve cultivated land resource, but it severely restricted the sustainable development of agricultural production. Owing to some factors such as the decreasing degree of cotton mechanization, increasing input of labor cost and production goods, declining comparative benefits, and implementing the strategy of food security, the cotton area in the Yangtze River and Yellow River is declining sharply, and the planting area is transferred to Binhai saline-alkali lands. Since the study of ecological security of planting Bt cotton in saline-alkali land is rare, it became the focus of many research studies worldwide. Whether the resistance of transgenic Bt cotton to cotton bollworm has been affected remains to be elucidated. Resistance is directly related to the environment safety of transgenic Bt cotton; therefore, there is an urgent need to solve the problems in cotton production. With the non-transgenic cotton as the control, we measured the corrected mortality of transgenic Bt cotton to cotton bollworm larvae and the contents of exogenous protein of transgenic Bt cotton that was planted in the low-, medium- and high-salt soil at seedling, budding, and flowering and bolling stages, respectively. The results showed that at the seedling, budding, and flowering and bolling stages of transgenic Bt cotton in low salt stress, the correction mortality of transgenic Bt cotton planted in the medium- and high-salt soil to cotton bollworm larvae decreased by 9.22%—47.46%, 31.61%—45.42%, and 3.59%—18.52%, respectively. Over the same period of Bt cotton, soil salinity significantly inhibited the expression of Bt protein in cotton leaves and decreased by 7.66%—29.86%, 3.77%—36.85%, and 18.13%—41.02% at seedling, budding, and flowering and bolling stages, respectively. There is a significant positive correlation between the efficiency of insect resistance of transgenic Bt cotton to cotton bollworm larvae and Bt protein content. Therefore, soil salinity levels inhibited the exogenous protein expression of transgenic Bt cotton, which led to the decreased resistance of transgenic Bt cotton on cotton bollworm. The present study on the effects and mechanisms of soil salinity on the influence of transgenic Bt cotton to cotton bollworm can provide a comprehensive basis for establishing Bt cotton pest prevention and control technology system, environmental safety evaluation, and safety management in soil salinity in Bt cotton fields.

KeyWords: soil salinity; transgenic Bt cotton; expression of the exogenous protein; insect resistance; temporal and spatial variation

氣候條件的日益惡化,土壤鹽漬化已成為制約世界農業可持續發展的重要因素[1- 2]。我國是鹽堿地面積最大的國家之一,棉花是我國重要的經濟作物,也是一種中等耐鹽堿作物,為保障我國糧食生產和棉花生產安全,潛在可利用的大面積鹽堿地是棉花生產的主要方向[3]。

鹽分對植株地上部形態、生理特征、光合作用、代謝進程等方面的影響的研究已引起很多專家和學者的關注與研究[4- 6]。我國轉Bt基因棉花的種植面積超過370萬hm2,占我國棉花種植面積的96%以上[7],轉Bt基因棉花不僅有效對抗棉花棉鈴蟲,也因為減少農藥的使用也對人類與環境友好[8],同時隨著轉基因抗蟲棉的推廣普及,棉田害蟲生態地位發生了重大變化,棉田次要害蟲上升為主要害蟲[9- 12],并呈現逐步蔓延和大面積災變的發展趨勢[13-18]；同時,環境條件對轉Bt基因棉花抗蟲效果有重要的影響[8],其中溫度[19-21]、干旱、澇漬[22-24]等逆境條件均能抑制棉花的抗蟲性和外源蛋白的表達量,而施氮量可促進轉Bt基因棉花外源蛋白的合成,促使棉花抗蟲性增強[25-26]。鹽脅迫轉Bt基因棉花對棉鈴蟲控制作用及其外源蛋白表達量變化方面的研究,Iqbal等[27]在對印度多種棉花進行了鹽脅迫和外源蛋白的檢測,表明脅迫鹽分濃度與外源蛋白含量成反比。Jiang等[28]在室內采用NaCl脅迫棉花結果表明,鹽分脅迫抑制了轉Bt基因棉花苗期葉片外源蛋白表達量。前人在室內且單一NaCl脅迫下在棉花苗期進行了實驗,對棉花生長后期外源蛋白表達量變化規律未見明確報道,對轉Bt基因棉花受鹽分脅迫響應的認識仍然有限,且棉田害蟲主要發生在棉花生長的中期和后期,土壤鹽分脅迫對棉花整個生長發育時期外源蛋白表達量時空變化直接影響轉Bt基因棉花對棉鈴蟲抗性的變化是目前生產上重要的需要解決的問題。

因此,在糧棉爭地矛盾日益突出,鹽漬化和次生鹽漬化土壤不斷加劇的背景下,基于轉Bt基因棉花向鹽堿地大面積轉移種植趨勢,明確鹽堿土壤種植轉Bt基因棉花其外源蛋白表達量時空變化規律及其與抗蟲性的關系,采取耐鹽堿栽培調控措施,增強棉花自身對外界逆境的抵御能力,提高棉花產量和品質是確保鹽堿地棉花豐產豐收的迫切需要和關鍵因素之一。本文以轉Bt基因棉花為試驗材料,以其親本非轉基因棉花為對照,在鹽堿地原位土柱中進行了連續2a的重復研究試驗,從土壤鹽分水平動態、轉Bt基因棉花葉片外源蛋白表達量時空變化入手,研究并闡明鹽堿土壤轉Bt基因棉花外源蛋白表達量時空變化對抗蟲性的影響,為棉花生產中增強鹽堿地轉Bt基因棉花對害蟲及外界逆境脅迫的抵御能力采取栽培調控技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

棉花材料 GK19為轉Cry1Ac基因棉花,啟動子為35s,終止子為NOS,由湖北省沙洋監獄管理局農業科學研究所、湖北省種子管理站、中國農業科學院生物技術研究所等單位選育,2002年通過山西省審定；泗棉3號為GK19的親本受體,為非轉基因棉花,均由湖北省農業科學院植保土肥所提供。

棉花種植 試驗于 2013年和2014年的 6月至9 月開展。棉花種植于江蘇大豐市稻麥原種場試驗農場。選擇田間鹽分水平差異較大的3個地塊作為低鹽、中鹽和高鹽脅迫處理,在各鹽分土壤原位設置土柱,棉花采用營養缽育苗移栽方法種植,棉花管理按高產栽培要求進行。

1.2 測定內容與方法

1.2.1 土壤鹽分測定

在棉花苗期、蕾期和花鈴期,用土壤取樣器采集棉株根際周圍0—2 cm范圍內距地表10—20 cm土層土壤室內自然風干后,研磨去雜過篩,采用“質量”法進行鹽分含量測定[29]。

稱取風干土樣100.0 g放入1000 mL廣口三角瓶中,加入去CO2水500 mL后塞緊瓶口,放入搖床120 rpm/min振蕩20 min,3000 rpm/min離心5 min至上清液透明；吸取上清液100 mL,移入已知重量的250 mL三角瓶中,放置在水浴上蒸干后放入烘箱105℃烘干4 h,取出移入干燥器中冷卻約30 min在分析天平上稱重；再放入烘箱105℃重復烘2 h,冷卻,稱至恒重,要求兩次重量之差不得大于0.0003 g?？扇苄喳}分計算公式如下：

可溶性鹽含量(%)=(m1-m0)/m× 100

式中,可溶性鹽總量為土壤可溶性鹽總量質量分數(%)；m1為燒杯與鹽分質量之和(g)；m0為空燒杯質量(g)；m為吸取待測液體積相當樣品質量(g)；100為換算成每百克含量。

1.2.2 轉Bt基因棉抗蟲性生物測定

(1)試蟲來源 棉鈴蟲由中國農業科學院棉花研究所養蟲室提供,系2012年9月采自田間,在室內(溫度:(27±0.5)℃,相對濕度: (75 ± 5%),光照周期；L∶D=14 h∶10 h)連續飼養10代,對化學農藥及轉Bt基因棉花或Bt制劑沒有抗性。

(2)棉鈴蟲抗性生物測定 參照農業行業標準《棉花抗棉鈴蟲性鑒定方法》(NY/T2162—2012)[30]和國家標準《轉基因植物及其產品環境安全檢測抗蟲棉花第1部分：對靶標害蟲的抗蟲性》(農業部1943號公告- 3—2013)[31],在棉花生長的苗期(二代棉鈴蟲發生期)分別采集棉花主莖功能葉,蕾期(三代棉鈴蟲發生期)和花鈴期(四代棉鈴蟲發生期)分別采集棉花上部果枝頂部嫩蕾對位葉進行室內抗蟲性生物測定。每小區采集10片棉花葉片,每片葉片裝進一個生物測定盒(高10 cm,直徑8 cm),人工接入1 d齡棉鈴蟲幼蟲,蓋緊盒蓋,置于溫度為(27±0.5)℃,相對濕度(75%±5%),光照周期L∶D=14 h∶10 h條件下飼養5 d,第6天調查生測盒內棉鈴蟲存活數；以非轉基因棉花泗棉3號葉片的棉鈴蟲幼蟲死亡率為對照,計算轉基因抗蟲棉GK19棉花對棉鈴蟲幼蟲抗性的校正死亡率。計算公式如下：

式中,處理材料幼蟲死亡率為轉基因抗蟲棉花幼蟲死亡率；對照材料幼蟲死亡率為非轉基因棉花幼蟲死亡率；1為校正常數。

1.2.3 外源Bt蛋白檢測

取樣 在棉花生長的苗期(二代棉鈴蟲發生期)分別采集棉花主莖功能葉,蕾期(三代棉鈴蟲發生期)和花鈴期(四代棉鈴蟲發生期)分別采集棉花上部果枝頂部嫩蕾對位葉。每小區采集5片葉片,-80℃速凍后保存,用于Bt蛋白表達量的測定；采樣時間和部位與生物測定取樣一致。

Bt蛋白檢測 采用ELISA方法,稱取新鮮棉花葉片0.4 g,液氮快速研磨,加入4 mL PBS提取液,4℃搖床(200 r/min)過夜；8000 r/min離心取上清待測；外源蛋白表達量檢測操作均按檢測試劑盒說明書嚴格進行,檢測試劑盒為美國ENVIROLOGIX公司生產的Cry1Ac/Cry1Ab(型號AP003 CRBS)檢測試劑盒。

1.3 數據統計與分析方法

利用 Excel 軟件對數據進行基本處理和篩選,針對研究區土樣和測定分析結果,運用 SPSS 17.0 軟件對所有數據進行統計分析,采用單因素方差分析(One-way analysis,ANO-VA) 和 Duncan′s 差異顯著性分析(P<0.05),檢驗同一時期不同小區轉Bt基因棉花室內生物測定及外源Bt蛋白含量顯著性差異；同時利用該軟件采用比較平均值方法進行了相關性分析。

2 結果

2.1 棉田土壤鹽分水平動態變化

土壤鹽分水平見表1。棉田土壤鹽分水平隨棉花生長發育時期和季節變化呈現出動態變化趨勢。2013年土壤鹽分水平分別在苗期、蕾期和花鈴期表現出逐漸升高的趨勢,2014年在苗期和蕾期表現升高,花鈴期下降；鹽分處理間差異顯著(2014年苗期除外)。

表1 土壤鹽分水平動態變化規律/%

SL：泗棉3號低鹽處理Treatment of low soil-salinity to Simian- 3；SM：泗棉3號中鹽處理Treatment of medium soil-salinity to Simian- 3；SH：泗棉3號高鹽處理Treatment of high soil-salinity to Simian- 3；GL：GK19低鹽處理Treatment of low soil-salinity to GK 19；GM：GK19中鹽處理Treatment of medium soil-salinity to GK 19；GH：GK19高鹽處理Treatment of high soil-salinity to GK 19；小寫字母表示同列中相同棉花品種在0.05水平差異顯著(P< 0.05)

2.2 土壤鹽分對轉Bt基因棉花抗棉鈴蟲幼蟲校正死亡率的影響

土壤鹽分對轉Bt基因棉花抗棉鈴蟲幼蟲校正死亡率的影響如表2。隨土柱土壤鹽分水平的升高,采自田間土柱中生長的棉花苗期功能葉、蕾期和花鈴期蕾對位葉對棉鈴蟲幼蟲校正死亡率呈逐漸下降趨勢,下降程度隨著鹽分水平的增加而增加,其中苗期和蕾期葉片抗性變化差異較大,花鈴期未達顯著差異。

與低鹽田相比,2013年中鹽田和高鹽田GK 19棉花苗期功能葉對棉鈴蟲幼蟲校正死亡率分別下降了28.05%和47.46%,蕾期分別下降了41.50%和45.42%,花鈴期分別下降了3.59%和18.52%。2014年中鹽田和高鹽田GK 19棉花功能葉對棉鈴蟲幼蟲校正死亡率分別下降了9.22%和23.08%,蕾期分別下降了31.61%和41.07%；花鈴期分別下降了15.81%和17.23%。表明隨土壤鹽分水平升高,轉Bt基因棉花葉片對棉鈴蟲幼蟲校正死亡率下降,下降幅度在不同時期和不同鹽分處理間有所不同。

表2 不同土壤鹽分水平下轉Bt基因棉花葉片對棉鈴蟲幼蟲抗性死亡率的影響/%

小寫字母表示同列在0.05水平差異顯著(P< 0.05)

2.3 土壤鹽分對轉Bt基因棉花外源蛋白表達量的影響

隨著棉花的生長發育進程和土壤鹽分水平的升高,采自田間土柱中生長的轉Bt基因棉花葉片中外源蛋白表達量均成逐漸下降趨勢。與低鹽水平相比(表3),2013年中鹽和高鹽脅迫GK19棉花苗期功能葉外源Bt蛋白表達量分別降低了7.66%和23.71%；蕾期分別下降了26.86%和36.85%；花鈴期分別下降了22.52%和41.02%。2014年中鹽和高鹽脅迫GK19棉花苗期功能葉外源Bt蛋白表達量分別降低11.52%和29.86%；蕾期分別下降了3.77%和31.81%；花鈴期分別下降了18.13%和38.32%。表明土壤鹽分可顯著降低轉Bt基因棉花外源蛋白表達量，但抑制程度與鹽分脅迫程度和脅迫時間有關。

表3 不同鹽分土壤水平對轉轉Bt基因棉花外源殺蟲蛋白表達量的影響/(ng/g)

小寫字母表示在0.05水平差異顯著

2.4 鹽堿土壤轉Bt基因抗蟲棉對棉鈴蟲校正死亡率與外源Bt蛋白表達量的相關關系

隨土壤鹽分水平變化轉Bt基因棉花對棉鈴蟲的抗蟲性與外源Bt蛋白表達量呈顯著的正相關關系(表4),表明在一定土壤鹽分脅迫條件下,轉Bt基因棉花抗蟲性的下降,主要可能是由于其外源Bt蛋白表達量降低的原因所形成。

表4 不同土壤鹽分轉Bt基因棉花抗蟲性與外源Bt蛋白表達量的相關性

*和**代表在0.05和0.01水平差異顯著

3 討論

3.1 鹽堿土壤對轉Bt基因棉花抗蟲性的影響

棉花葉片是棉鈴蟲取食的重要器官。轉Bt基因棉花對棉鈴蟲幼蟲校正死亡率越高,其對棉鈴蟲抗蟲性越高,反之則抗蟲性越低。

高溫、干旱和澇漬、氮素等環境條件均能影響轉Bt基因棉花外源蛋白的表達,進而影響其抗蟲性變化。但鹽堿脅迫轉Bt基因棉花對其抗蟲效果和外源蛋白表達量的研究方面也有學者在室內通過單一NaCl脅迫棉花苗期進行研究。本文是在鹽堿地自然條件下設置原位土柱中進行的脅迫試驗,明確了鹽堿土壤轉Bt基因棉花葉片對棉鈴蟲的抗蟲性具有時空動態性,鹽分脅迫下轉Bt基因棉花葉片對棉鈴蟲抗蟲性下降,而Jiang 等[28]在室內研究結果顯示NaCl脅迫轉基因棉花苗期葉片對棉鈴蟲的抗性未達到顯著差異水平,本文測得的轉基因棉花葉片對棉鈴蟲的抗性程度下降,可能是由于前人是在室內幼苗期單一鹽分條件下進行的試驗,本文是在田間自然狀態下進行的試驗,田間鹽分表現形式不同,鹽離子種類也比較復雜,引起轉基因棉花抗蟲性的變化有差異；同時采樣時期都是在苗期,但本文是在5—7葉期進行采樣測定,可能與前人采樣時期有差異而形成；另外前人與本試驗所使用的轉基因棉花品種不同,棉花品種本身蛋白含量表達量高，鹽分脅迫后外源蛋白含量的下降量不足以引起抗蟲性的下降，可能也是出現影響差異的原因。

3.2 鹽堿土壤對轉Bt基因棉花外源蛋白表達量的影響

轉Bt基因棉花抗蟲的物質基礎是外源蛋白的表達[32- 33],Bt蛋白的表達受棉株生長發育及環境變化的調控[34],且對調控因素具有高度的依賴性[35- 37]。本文系統測定了采自鹽堿地原位土柱種植的轉Bt基因棉花葉片中外源蛋白表達量,表明鹽堿地轉Bt基因棉花外源蛋白表達量呈時空動態性,揭示了土壤鹽分含量顯著抑制了轉Bt基因棉花外源蛋白的表達,與Iqbal等[27]、李茂營[38]在室內或鹽池內采用NaCl脅迫棉花生長測定Bt蛋白質含量變化趨勢一致。同時本文對土壤鹽分脅迫下轉基因抗蟲棉花葉片中外源蛋白表達量和抗蟲性兩者相關關系進行分析,明確了鹽堿土壤轉Bt基因棉花葉片對棉鈴蟲抗蟲性下降的物質機制主要是由于轉Bt基因棉花受到鹽分脅迫后其外源蛋白表達量下降而造成的，但不同鹽分脅迫程度和脅迫時間，對棉花外源蛋白表達量和抗蟲性影響不同。但年度間差異主要原因可能是因為取樣時降雨或棉田灌溉引起鹽分下移,上層土壤中鹽分含量降低,在后續研究中應結合土壤肥力、土壤理化性質和氣象因子(尤其是淋雨)進行系統分析；同時可能由于棉花根系較大,只測定10—20cm土層的土壤鹽分對棉花的脅迫作用尚不夠完善,需進行不同深度土壤層鹽分的脅迫成都進行深入分析。

本文試驗是在自然田間鹽堿地進行的原位土柱試驗,土柱土壤鹽分與大田土壤鹽分基本一致。隨著棉花生育時期和季節變化規律,鹽分也在不斷變化,且是在整個棉花生長發育最關鍵的時期苗期、蕾期和花鈴期進行的系統研究,此期正是棉田害蟲發生的重要時期。因此該鹽分脅迫試驗更有利于了解鹽堿地轉Bt基因棉花的抗蟲性和外源蛋白表達量在整個棉花生長季隨土壤鹽分水平變化的變化規律,可跟隨變化的實際情況,采用栽培措施改變鹽分對轉基因抗蟲棉的脅迫,同時需適時監測棉田棉鈴蟲發生種群動態,并根據監測動態進行適時防治。

4 結論

隨著棉花生育進程,轉Bt基因棉花對棉鈴蟲抗性校正死亡率和外源Bt蛋白含量呈下降趨勢。鹽堿土壤種植轉Bt基因棉花對其抗棉鈴蟲校正死亡率和外源Bt蛋白表達量有顯著抑制作用。本實驗條件下土壤鹽分水平升高,其降低幅度越明顯。相關性分析表明,土壤鹽分降低了轉Bt基因棉外源殺蟲蛋白表達量,致使轉Bt基因棉花對棉鈴蟲抗性下降。說明鹽堿土壤種植轉Bt基因抗蟲棉,外源殺蟲蛋白表達量受到抑制,不利于抗蟲棉對棉鈴蟲的抗性優勢的發揮；同時由于室內離體測定結果與田間自然條件下棉花生長狀態及棉田氣候等造成田間棉鈴蟲種群動態的發生危害情況還有一定的差距,相關田間的研究報道較少,還需要監測棉田害蟲發生動態,根據害蟲實際消長動態情況適時進行化學防治。

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TheeffectsoftemporalandspatialvariationofexogenousproteinoftransgenicBtcottontoinsectresistanceinsaline-alkalisoil

LUO Junyu1, CUI Jinjie1, ZHANG Shuai1, ZHU Xiangzhen1, LU Limin1, WANG Chunyi1, ZHANG Lijuan1, WANG Li1, LI Chunhua1, ZHOU Zhiguo2,*

1InstituteofCottonResearchofChineseAcademyofAgriculturalSciences/StateKeyLaboratoryofCottonBiology,Anyang455000,China2CollegeofAgriculture,NanjingAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofCropPhysiology&EcologyinSouthernChina,MinistryofAgriculture,Nanjing210095,China

國家自然科學基金(31501253)

2016- 05- 30; < class="emphasis_bold">網絡出版日期

日期:2017- 03- 27

*通訊作者Corresponding author.E-mail: giscott@ njau.edu.cn

10.5846/stxb201605301036

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