茶樹類黃酮3′-羥化酶基因的克隆與表達特性分析

王文麗，吳致君，劉志薇，王永鑫，李輝，崔新，莊靜

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茶樹類黃酮3′-羥化酶基因的克隆與表達特性分析

王文麗，吳致君，劉志薇，王永鑫，李輝，崔新，莊靜*

南京農業大學園藝學院，茶葉科學研究所，江蘇南京210095

類黃酮3′-羥化酶（Flavonoid 3′-hydroxylase, F3′H）是細胞色素P450酶家族（Cytochrome P450，CYP450）的單加氧酶，在植物次生代謝和逆境調控方面起著重要的作用。本實驗以茶樹品種龍井43作為試驗材料，利用RT-PCR方法，從cDNA中克隆得到茶樹中編碼類黃酮3′-羥化酶基因，命名為′。序列分析顯示，′基因開放閱讀框為1?530?bp，編碼509個氨基酸，含有相對保守的P450酶系結合域。進化樹分析表明，CsF3′H1與CsF3′H3的進化樹關系相近，與CsF3′H2的進化樹關系較遠。序列多重比對顯示，CsF3′H1蛋白具有F3′H蛋白的特征基序，并與高粱、獼猴桃、楊樹、擬南芥和葡萄同源蛋白一致性為66.48%。氨基酸組分、理化性質、親水性/疏水性和無序化分析顯示，CsF3′H1是親水性蛋白，無序化特征不明顯。利用實時熒光定量PCR對′基因在茶樹不同組織和不同激素處理下的表達譜進行檢測，結果顯示：不同組織中，′基因的表達水平在第一葉中最高，之后隨著葉片的成熟逐漸下降，′基因在老葉和根中幾乎不表達，表達水平從高到低依次為第一葉>第二葉>第三葉>第四葉>嫩莖>根>老葉；在不同激素處理中，′在SA激素處理下的表達量最高，為對照的2.24倍，在MeJA處理下表達量最低，為對照的0.43倍。

茶樹；類黃酮3′-羥化酶；進化樹分析；組織表達；激素處理

類黃酮3′-羥化酶是細胞色素P450（Cytochrome 450）酶家族中的單加氧酶[1]。細胞色素單加氧酶P450（CYP450）在生物界中廣泛存在，是一大類定位在膜上的血紅素蛋白[2]。Brugliera等從矮牽牛（）中首次分離了′基因，被鑒定屬于CYP75B2基因家族[3]。F3′H蛋白具有催化多種依賴NADPH或NADH的底物氧化反應的功能[3-5]。之后陸續在擬南芥（）、玉米（）、金魚草（）、矢車菊（）、紫莖澤蘭（）、大豆（）、葡萄（）和蘋果（）等眾多植物中分離和鑒定了′基因[6-11]。

茶具有抗癌、抗心血管疾病、抗輻射、抗氧化和減肥等功能。茶的這些功能與茶葉中富含多酚類次生代謝產物密切相關[6, 12-14]。類黃酮代謝途徑是茶樹中重要的次級代謝途徑。類黃酮代謝途徑中的中間產物能保護植物免受UV照射和昆蟲的傷害，能通過調控花朵和種子的色素沉積，來吸引授粉者和種子傳播者[15-16]。類黃酮3′-羥化酶（Flavonoid 3′-hydroxylase, F3′H）催化柚皮素（Naringenin）和二氫山奈素（2,3-dihydrokaempf, DHK）的B-環3′位置羥基化，分別生成圣草酚（Eriodictyol）和二氫槲皮素（2,3-dihydroquercetin, DHQ），是類黃酮代謝途徑中的關鍵酶[17]。

本實驗從茶樹品種龍井43的cDNA中克隆得到1個′基因，命名為′。對該基因推導的氨基酸序列進行了序列比對、理化性質和親/疏水性等方面的分析。本實驗通過熒光定量PCR方法檢測了′基因在龍井43茶樹不同組織中和激素處理下的表達水平，為進一步研究茶樹中類黃酮代謝途徑及不同激素處理下′響應機制提供了實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本實驗材料選用種植在南京農業大學茶葉科學研究所的兩年生龍井43（cv.）扦插盆栽幼苗。取龍井43扦插幼苗的幼嫩葉，提取RNA，再反轉錄成cDNA，作為′基因克隆的模板。

選取龍井43茶樹兩年生植株，對其葉片進行脫落酸（0.1?mmol·L-1ABA）、生長素（1?mmol·L-1IAA）、水楊酸（1?mmol·L-1SA）、赤霉素（1?mmol·L-1GA3）和茉莉酸甲酯（1?mmol·L-1MeJA）激素處理2?h。未做任何處理的茶樹葉片作為對照。另外選取多株龍井43兩年生植株的第一葉混樣、第二葉混樣、第三葉混樣、第四葉混樣、老葉混樣、嫩莖混樣和根混樣作為不同組織基因表達材料。對上述取得的樣品進行RNA提取，反轉錄為cDNA，用于實時熒光定量。

1.2 總RNA的提取及cDNA合成

使用Biotake Corporation（南京華普生物科技有限公司）試劑盒提取根組織的總RNA，使用Quick RNA Isolation Kit（北京華越洋公司）試劑盒提取葉和嫩莖組織的總RNA。用Nanodrop ND 1000（上海譜元儀器有限公司）檢測提取的RNA樣品濃度。用1.2%凝膠電泳檢測RNA質量。利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（大連TaKaRa公司）試劑盒將提取的總RNA樣本反轉錄成cDNA。

1.3 茶樹CsF3′H1基因克隆

基于本實驗室課題組茶樹轉錄組數據[18]，得到1個茶樹′轉錄本序列，并根據此序列設計1對克隆引物：

CsF3′H1-QF：ATGGAGACTCATTCCTGGATTGT；

CsF3′H1-QR：CTAATAAAGGCGACCTGAGAGC

擴增體系：2×Plus Master Mix酶10?μL、ddH2O 7?μL、模板1?μL和引物各1?μL。反應條件：94℃預變性5?min；94℃ 30?s，55℃ 30?s，72℃ 90?s，共32個循環；72℃ 10?min。之后進行PCR產物的分離和回收。以pMD 19-T作為載體進行連接，成功轉化到大腸桿菌上后送測。委托南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。

1.4 生物信息學分析

核苷酸和蛋白質的BLAST比對和保守域預測在NCBI（美國國立生物技術中心）網站完成。氨基酸序列的多重比對和親疏水性分析利用DNAMAN 6.0軟件完成。利用在線工具包(SMS) (http://www.bio-soft.net/sms）和ExPASy- ProtParam (http://web.expasy.org/protparam）分析氨基酸的組成及理化性質。利用MEGA 5.0[19]軟件構建系統發育樹。熒光定量PCR數據的分析和圖表繪制在Origin 6.0軟件上進行。

1.5 茶樹CsF3′H1基因的表達特性分析

實時熒光定量PCR（Quantitative real time RT-PCR）的步驟按照SYBR Premix試劑盒（大連TaKaRa公司）的操作說明進行。CFX96real-time PCR system作為熒光定量PCR平臺，設計1對檢測引物：

CsF3′H1-JF：CTATTGCAGCTTCTTGATGATCCGA

CsF3′H1-JR：GCTCTTTGGTTGCTTTGTTGATTAG

以茶樹基因作為組織表達和激素處理的內參基因[20]：

TBP-JF：GGCGGATCAAGTGTTGGAAGGGAG

TBP-JR：ACGCTTGGGATTGTATTCGGCATTA

相對定量計算采用2–ΔΔT方法[21]。

2 結果與分析

2.1 茶樹CsF3′H1基因的克隆

提取正常生長的龍井43扦插幼苗嫩葉的RNA，再反轉錄成cDNA，利用引物CsF3′H1-QF和CsF3′H1-QR進行PCR擴增，對擴增片段進行測序。結果如下：′基因開放閱讀框長度為1?530?bp，編碼509個氨基酸（圖1）。

2.2 茶樹CsF3′H1蛋白進化樹分析

為了分析CsF3′H1蛋白在P450超基因家族蛋白的進化樹關系。利用MEGA 5.0軟件構建CsF3′H1蛋白與擬南芥P450超基因家族的進化樹。結果顯示（圖2），CsF3′H1和CsF3′H3蛋白的進化樹關系較接近，與CsF3′H2蛋白的進化樹關系較疏遠。

2.3 茶樹CsF3′H1蛋白氨基酸序列比對

利用NCBI對CsF3′H1氨基酸序列進行BLAST同源檢索與比對（圖3）。結果顯示，CsF3′H1蛋白含有P450家族典型的保守域，是P450超基因家族中的一員[22]。選取高粱、獼猴桃、擬南芥、葡萄和楊樹4個代表性物種中的F3′H1同源蛋白與茶樹的CsF3′H1蛋白進行序列的多重比對（圖4）。結果顯示，6個蛋白氨基酸序列的一致性為66.48%。在蛋白序列的N端含有膜的錨定位點基序，在C端含有與血紅素結合區有關的氨基酸基序。

圖1 茶樹CsF3′H1基因核苷酸序列與推測的氨基酸序列

圖2 茶樹CsF3′H1蛋白的進化樹分析

圖3 茶樹CsF3′H1蛋白的保守域預測

注：a：膜的錨定位點；b：與底物的選擇和結合有關的氨基酸殘基；c：與血紅素結合區有關的氨基酸殘基。

Note: a: The residues proposed to anchor. b: Residues of the active site hydrogen bond network. c: Residues of the heme-binding region.

圖4 茶樹′基因推導蛋白保守域及與其他物種氨基酸序列的多重比對

Fig. 4 The conserved domain and multiple alignment of CsF3′H1 protein

2.4 茶樹CsF3′H1蛋白氨基酸的理化性質分析

F3′H1蛋白組成成分和理化性質的分析采用Gasteiger等[23]的方法（表1），結果顯示上述植物的F3′H1蛋白氨基酸殘基數在507~518之間，相對分子量為（5.59~5.83）×104。理論等電點（）均在7~10之間。堿性氨基酸的平均含量為14%，酸性氨基酸的平均含量為10%左右，芳香族氨基酸和脂肪族氨基酸平均含量分別為7%和25%，總平均疏水性在蛋白質可溶性預測中處于－0.333~0.048之間。總之，不同的物種中F3′H1蛋白的理化性質存在一定差異，親緣關系相近的物種差異相對較小。

表1 不同植物中F3′H1氨基酸組成成分及理化性質分析

2.5 茶樹CsF3′H1蛋白推導的氨基酸親/疏水性和無序化分析

利用DNAMAN 6.0軟件對茶樹′基因推導的氨基酸序列進行親水性/疏水性分析。如圖5顯示，該蛋白疏水性最強的位點是在第373位的纈氨酸（Val），其次是第9位的亮氨酸（Leu）；親水性最強的位點是265位的谷氨酸（Glu），其次是第151的谷氨酸（Glu）。總的看來，大多數的氨基酸屬于親水性氨基酸。CsF3′H1蛋白氨基酸序列的折疊無序化分析結果（圖6）顯示，CsF3′H1無序化區域在整個氨基酸序列中占5個，最長的無序化區域含有氨基酸數為9個。無序化區域共含有37個氨基酸殘基（圖6中下劃線部分），無序化比例為7.27%。總體而言，CsF3′H1蛋白氨基酸序列無序化程度不明顯。

注：有下劃線標注的是無序狀態氨基酸，無下劃線標注的是有序狀態氨基酸。

Note: Amino acids represented non-ordered and ordered regions are showed in underline and non-underline, respectively.

圖6 茶樹CsF3′H1折疊狀態的分析

Fig. 6 Analysis of the folding state of CsF3′H1

2.6 茶樹CsF3′H1基因在不同組織中的表達分析

通過熒光定量PCR，檢測了龍井43茶樹中′基因在不同組織中的表達情況（圖7）。結果顯示，′基因在不同組織中表達差異很大，在第一葉中的表達量最高，隨著葉片的發育，在第二、三、四葉中表達量逐漸下降，在根和老葉中的表達量幾乎檢測不到；′基因在第一葉中的表達量分別是根和老葉中的250倍和500倍；在不同組織中′基因的表達水平從高到低依次為：第一葉>第二葉>第三葉>第四葉>嫩莖>根>老葉。

2.7 茶樹CsF3′H1基因在不同激素處理下的表達分析

用水楊酸、赤霉素、茉莉酸甲酯、脫落酸、吲哚乙酸5種激素分別處理茶樹葉片2?h，結果（圖8）顯示，在水楊酸處理下′基因的表達量最高，為對照的2.24倍；′基因在茉莉酸甲酯處理下表達量最低，僅為對照的43%；與對照相比，′基因只有在水楊酸處理下表達量顯著上調，在茉莉酸甲酯處理下表達量顯著下調。

注：不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。下同。

圖8 CsF3′H1基因在茶樹不同激素處理下的表達分析

3 討論

類黃酮代謝途徑是高等植物中重要的次級代謝途徑之一。在植物中，′在決定植物花色、種皮和莖葉著色等性狀方面發揮著重要的作用，′與′′的比例決定著葡萄果實著色的程度[17]。在茶樹中，類黃酮途徑中的代謝產物兒茶素能幫助人體提高抗癌、抗氧化、抗誘變、抗腫瘤和抗心血管疾病的能力[12-14]。類黃酮3′-羥化酶是類黃酮代謝途徑中的關鍵酶，能催化柚皮素和二氫山奈素的B環3′位置羥基化。柚皮素和二氫山奈素被氧化形成一系列類黃酮途徑中重要的中間產物，這些中間產物的結構穩定性和抗氧化功能與F3′H酶類密切相關[24]。Zhou等[25]的酶活實驗中，鑒定了柚皮素是CsF3′H的最適底物[25]。

P450家族是植物中古老的超基因家族，按功能分類，主要分為參與生物合成和生物解毒兩大類[26]。經鑒定，CsF3′H蛋白的F439GSGRRMCPG448血紅蛋白結合區是P450超基因家族的典型特性基序，N端存在的P34PGP37保守位點是膜的錨定位點，G308TDTSA313基序一般是與底物選擇相結合的殘基位點[27-28]。進化樹分析顯示，CsF3′H1蛋白和CsF3′H3蛋白的進化樹關系較接近，與CsF3′H2蛋白的進化樹關系較遠，CsF3′H2蛋白屬于CYP75B1亞家族。這與Zhou等[25, 29]的實驗結論相一致。

本實驗從茶樹中克隆獲得1個編碼F3′H酶的′基因，該基因開放閱讀框長度為1?530?bp，編碼509個氨基酸。大多數氨基酸屬于親水性氨基酸，無序化程度不明顯。通過定量表達分析該基因在不同組織和不同激素下表達量的變化，不同組織中，熒光定量PCR分析顯示′基因的表達水平在第一葉中表達量最高，從第一葉到老葉表達量依次遞減，在老葉和根中的表達水平幾乎檢測不到，在嫩莖中的表達水平遠小于鮮葉。推測′基因存在組織特異性，在鮮葉中的表達較高。Jiang等[18, 30]的研究表明茶樹葉片中多酚類物質主要集中在嫩葉部位，推測′基因在類黃酮代謝途徑中起正調控作用。

激素能通過信號轉導啟動或阻遏下游相關基因來發揮其作用。外源激素的噴施能明顯地影響茶樹的生長發育和鮮葉內含物質的生成[31]。響應不同激素刺激方面，′的表達水平除了在水楊酸處理下顯著升高外，在其余激素處理下的表達量均處于下調狀態。推測水楊酸能誘導′基因的表達，茉莉酸甲酯則抑制′基因的表達，赤霉素、脫落酸和吲哚乙酸對′的影響不大。

本實驗研究了′基因在不同組織和激素刺激中的表達情況，推測′基因可能影響了兒茶素的合成。為進一步研究茶樹中F3′H1蛋白的結構和功能奠定一定的理論基礎。

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Cloning and Expression Analysis of the Gene Encoding Flavonoid 3′-Hydroxylase in Tea Plant ()

WANG Wenli, WU Zhijun, LIU Zhiwei, WANG Yongxin, LI Hui, CUI Xin, ZHUANG Jing*

Tea Science Research Institute, College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjin 210095, China

Flavonoid 3′-hydroxylase (F3′H) belongs to the family of cytochrome P450 monooxygenases (CYP450) and plays important roles in plant secondary metabolism and stress reponses. In this study, a gene encoding F3’H-like protein was cloned by RT-PCR method using a cDNA template from tea () cultivar ‘Longjing43’. This gene is named as′. Sequence analysis showed that the open reading frame ofwas 1,530 bp length, encoding 509 amino acids. CsF3′H1 protein contains the conserved binding domain of P450 enzyme. Analysis of phylogenetic tree showed that CsF3'H1 protein has high similarity with CsF3'H3 protein and has low similarity with CsF3'H2 protein. Multiple alignments showed that CsF3'H1 protein has high similarity with the F3′H homologs from,,,, and(66.48% identity). CsF3'H1 protein contains the characterized motifs of F3'H-type protein. Analysis of amino acid composition, physical and chemical properties, hydrophilicity/hydrophobicity, and disordered residues of CsF3′H1protein showed that the disordered residues of CsF3′H1 protein are not obvious and most amino acids of CsF3′H1 protein are hydrophilic. The expression profiles of′gene in different tissues of tea plant or under hormonal treatments were detected using quantitativereal-time PCR analysis. Results showed that:gene has the highest expression level in the first leaf. The tissue expression profiles showed that the successive order ofgene expression levels was the first leaf > the second leaf > the third leaf > the fourth leaf > stem > roo > old leaf. The expression levelofgene was highest under SA treatment, which was 2.24 times high than the control.gene had the lowest expression level under MeJA treatment.

, flavonoid 3′-hydroxylase, phylogenetic tree, tissue expression, hormonal treatments

S571.1；Q52

A

1000-369X(2017)01-108-11

2016-08-22

2016-10-24

國家自然科學基金（31570691）

王文麗，女，碩士研究生，主要從事茶樹分子生物學研究，E-mail：493930696@qq.com。

zhuangjing@njau.edu.cn