武夷巖茶種質資源遺傳多樣性與親緣關系的SRAP分析

夏法剛，衷興旺，吳鋒，季彪俊

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武夷巖茶種質資源遺傳多樣性與親緣關系的SRAP分析

夏法剛1，衷興旺2，吳鋒1，季彪俊1

1. 福建農林大學作物科學學院，福建福州350002；2. 武夷山市茶葉產品質量檢驗所，福建武夷山354300

本研究利用SRAP-PCR反應體系，從88對SRAP引物組合中篩選出43對引物組合，對武夷巖茶主要的30份種質資源進行SRAP分析，共擴增出385條帶，其中具有多態性的有236條帶，占總數的61.30%，表明30份武夷巖茶種質呈現一定的遺傳多樣性。武夷巖茶種質資源間遺傳距離變幅在0.31~0.98之間，平均為0.63，基于SRAP標記利用系統聚類法把武夷巖茶分為三大類，為武夷巖茶遺傳研究、品種選育與資源保護提供參考。

武夷巖茶；種質資源；SRAP標記；遺傳多樣性；親緣關系

武夷山是烏龍茶的發源地，保存有大量茶樹種質資源，是烏龍茶種質保存的核心區[1]。武夷巖茶的品質主要取決于茶樹品種和其獨特的制作工藝。其中，起決定作用的是茶樹品種的特征品質。武夷山獨特的環境條件孕育了大量優質茶樹種質資源，素有“茶樹品種王國”之稱[2]，但這些優質的種質資源需進一步開發利用[3]，才能充分發揮其優勢。目前國內外學者對武夷巖茶的生物學特性[1]、營養成分[4]、烘焙技術[5-6]、品質形成[7-8]等方面進行了大量的研究，但對武夷巖茶種質資源遺傳多樣性方面的研究比較少。本研究以武夷巖茶中主要的30份種質資源為研究對象，通過SRAP分子標記技術對武夷巖茶的遺傳多樣性進行研究，為武夷巖茶種質資源的鑒定和評價奠定基礎，并從中篩選優質資源，為武夷巖茶種質資源的保護、利用和遺傳改良等方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

30份武夷巖茶種質資源試驗材料收集自武夷山茶葉科學研究所資源圃，各材料編號見表1。

表1 試驗材料名稱及編號

1.2 試劑與儀器

Taq DNA聚合酶、dNTP、10×PCR buffer、MgCl2及標準分子量（Marker）B030t和植物基因組DNA提取試劑盒等購自鼎國生物技術有限公司，溴酚藍、氯化鈉、β-巰基乙醇、無水乙醇、異戊醇等其他試劑均為國產分析純。

PCR儀為美國伯樂（BIO-RAD）S1000 Thermal Cycler，電泳儀采用北京六一儀器廠生產的DYY-5型穩壓穩流電泳儀，索福Legend Micro17微量臺式離心機，eppendorf 5415R冷凍離心機，DYY-6C型電泳儀，美國伯樂（BIO-RAD）凝膠成像儀，電熱恒溫水浴鍋，eppendorf移液槍，冰箱，微波爐，高壓滅菌鍋等。

1.3 引物

SRAP正反向引物采用Li和Quiros[9]、Vandemark等[10]和Ferriol等[11]發表的引物序列（表2），SRAP引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 試驗方法

1.4.1 基因組DNA的提取步驟

基因組DNA提取按照試劑盒說明進行。

1.4.2 DNA質量檢測

電泳檢測提取的基因組DNA質量，紫外分光光度計檢測茶葉基因組DNA濃度：將待測樣品適當稀釋（茶葉DNA 10?μL用TE緩沖液稀釋至2?000?μL）后，TE緩沖液進行調零，設定紫外光波長，分別測定230、260、280?nm波長時的OD值，并計算DNA的純度和濃度。根據計算的濃度稀釋至20?mg·L-1，然后放入－20℃保存備用。

1.4.3 SRAP-PCR體系

SRAP擴增反應體系：Mg2+濃度3.0?mmol·L-1，Taq酶2.0?U，dNTPs濃度0.2?mmol·L-1，引物濃度2.0?μmol·L-1，10×Buffer 2.0?μL，模板DNA 20?ng；反應總體積為25?μL。經過重復試驗，確定SRAP-PCR擴增程序為：94℃預變性5?min；94℃變性1?min，35℃復性1?min，72℃延伸100?s，5個循環；94℃變性1?min，50℃復性1?min，72℃延伸100?s，35個循環；最后72℃延伸5?min。對30份資源DNA進行SRAP擴增，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴增產物進行檢測。

表2 武夷巖茶遺傳多樣性研究的SRAP引物序列

1.4.4 種質資源遺傳多樣性分析

引物序列見表2。首先從30份茶樹種質資源中選出6份形態特征差別比較大的2、3、6、7、8、16共計6個品種，對88對引物進行篩選，從88對引物中篩選出多態性高、重復性好的引物用于PCR擴增。反應體系見1.4.3，擴增產物經7.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳，進行觀察并拍照。

1.4.5 數據統計和分析

對獲得的SRAP-PCR擴增條帶進行統計，在相同遷移位置，當出現清晰可辨的電泳條帶時標記為1，模糊或不存在條帶記為0。通過DPS7.05計算各品種之間的遺傳距離，將數據導入MEGA7，構建進化樹[12]。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA的提取與檢測

利用試劑盒提取的茶葉DNA整體質量良好，DNA拖尾現象不明顯（圖1中的1~10泳道），證明RNA的干擾比較小，DNA的條帶整體清晰、帶型好，而且DNA溶液呈無色透明，說明DNA中雜質較少，可用于進行SRAP相關試驗。

2.2 SRAP多態性引物的篩選

首先從30份茶樹種質資源中選出6份形態特征差別比較大的2、3、6、7、8、16共計6個品種對88對引物進行篩選，從88對引物中篩選出多態性高、重復性好的43對引物用于PCR擴增。利用上述6個品種分別對Me8/Em7、Me8/Em8、Me8/Em9、Me8/Em10、Me8/Em11共5對引物進行篩選（圖2）。從圖中可以看出，Me8/Em7、Me8/Em9、Me8/Em10、Me8/Em11這4對引物擴增的多態性比較高。從88對引物中共篩選出多態性高的43對引物，并用這43對引物對30份烏龍茶種質資源進行擴增。

2.3 武夷巖茶種質資源的SRAP擴增結果

用獲得的43對能產生清晰可辨別擴增條帶的引物組合對30份武夷巖茶種質進行擴增，共擴增出385條帶，其中具有多態性的有236條，占總數的61.30%，表明30份武夷巖茶種質呈現一定的遺傳多樣性。平均來看，每對引物可擴增出8.95條帶，其中具有多態性的有5.49條帶。43對SRAP引物擴增的條帶見表3。其中Me3/Em6這對引物擴增出15條帶，在所有引物中擴增出條帶數最多。

注：M：DL15000，1~10泳道：1~10號烏龍茶基因組DNA。

注：品種從左到右依次為2、3、6、7、8、16，引物分別為Me8/Em7、Me8/Em8、Me8/Em9、Me8/Em10、Me8/Em11。

2.4 武夷巖茶種質資源的遺傳距離分析

利用DPS7.05版本計算武夷巖茶種質資源間的平均遺傳距離，遺傳距離變幅在0.31~0.98之間，平均為0.63，說明武夷巖茶種質資源間遺傳差異較大。根據遺傳距離矩陣表計算出30份武夷巖茶種質資源間的平均遺傳距離（表4）在0.53~0.95之間。其中1號平均0.95，排在第1位，11號和24號排在第2和第3位，分別達到0.76和0.71，說明這3個種質資源與其他種質資源的差異較大，關系較遠。

2.5 基于SRAP的30份武夷巖茶種質資源聚類分析

將獲得的武夷巖茶種質資源的SRAP標記轉化成[0, 1]原始矩陣，并通過DPS7.05計算出遺傳距離，將數據導入MEGA7，構建系統樹（圖3）。從圖中可以看出，30份武夷巖茶可分為三大類，其中1號北斗單獨歸于第I類群，北斗原產北斗峰，后經引種栽培，與其他武夷巖茶種質資源差異較大，性狀特征差別也比較明顯。11號半天妖和17號奇蘭歸為第Ⅱ類群，半天妖為武夷山傳統五大名叢之一，原產三花峰之第三峰絕頂崖上，相傳“此茶非人所植，系古時飛鳥由他山喙銜茶籽，落此生成”，因此與其他種質資源區別比較大。剩余27份種質資源歸于第Ⅲ類群，其中26號梅占與29號金毛猴遺傳親緣關系較近，8號水金龜和21號黃玫瑰、4號矮腳烏龍和27號毛蟹、9號金鎖匙和22號丹桂親緣關系較近，18號金牡丹、19號金觀音和20號黃觀音都是鐵觀音的后代，因此遺傳親緣關系也較近。

表3 43對引物組合的SRAP擴增結果及多態性信息

表4 30份武夷巖茶種質資源與其他種質資源的平均遺傳距離

3 討論

SRAP標記是根據基因的外顯子和內含子特點設計引物進行PCR擴增的一種分子標記技術，具有穩定、簡單、快速、高效等優點，已在玉米[13]、小麥[14]、青稞[15]等糧食作物的遺傳多樣性分析中證實。沈程文等[16-17]利用SRAP技術對廣東25份地方茶樹種質資源和5個不同地區的對照品種進行了遺傳多樣性研究，發現廣東茶樹種質資源間存在一定的遺傳多樣性，共擴增出127條帶，多態性比率達88.67%，證明了SRAP標記在茶樹種質資源分析中的可行性。

武夷巖茶種質資源遺傳多樣性研究未見相關報道，本研究利用43對SRAP引物組合對30份武夷巖茶種質進行擴增，共擴增出385條帶，其中具有多態性的有236條，占總數的61.30%。平均來看，每對引物可擴增出8.95條帶，其中具有多態性的帶有5.49條，這與沈程文等[16]對廣東茶樹（4.83條）種質資源的研究相近，進一步證明了SRAP技術比較適合茶樹種質資源的遺傳多樣性分析。

李振剛[18]通過RAPD分析將30份茶樹種質資源中的26份歸為一類群，其中部分為目前的主栽品種，親緣關系較近，而且30份品種中多數原產于安溪。而在本研究中，30份武夷巖茶種質資源有27份歸為一大類，這些武夷巖茶種質資源的地理分布與聚類分析并不完全一致，這可能是由于地區間引種交流所致，可能表明福建烏龍茶種質資源和加工技術是由武夷山傳播到安溪的傳播路徑具有一定的關系[19]。種質資源引入后，經過后天的人工選擇和種質資源對環境條件選擇進化，從而表現出不同的性狀特征，由于武夷山和安溪兩地的氣候條件差異明顯，所以茶樹種質資源群體間在萌芽期、開花期、種子成熟期、花器、果實、種子等性狀等方面存在一定差異[20]。如何篩選優異武夷巖茶種質資源，合理選擇優勢互補、親緣關系較遠的父母本是當前巖茶茶樹育種中的重要問題，SRAP分子標記從分子水平上揭示了品種的特征特性及親緣關系，具有不受生長發育時期、部位和環境等因素的限制，可以快速、高效、靈敏地鑒定品種間的親緣關系，結合生物學特征特性進行雜交，可獲得遺傳基礎廣泛、變異豐富的后代，從而為新品種選育、品種鑒定和種質保存奠定基礎。

圖3 烏龍茶種質資源的聚類圖

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SRAP Marker Analysis of Genetic Diversity and Relationship in Wuyi Rock Tea Germplasm Resources

XIAFagang1, ZHONG Xingwang2, WU Feng1, JI Biaojun1

1. Crop Science College of Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2. Tea products Quality Inspection Institute of Wuyishan City, Wuyishan 354300, China

The genetic diversity and relationship of 30 Wuyi rock tea germplasms were analyzed by Sequence-related amplified polymorphism (SRAP) markers. Forty three pairs of primers selected from 88 pairs of candidate SRAP primers produced 385 amplified fragments. Among them, 236 were polymorphic, accounting for 61.30% of the total fragments. The results showed that there was distinct genetic diversity within Wuyi rock tea germplasms. The genetic distance ranged from 0.31 to 0.98 with an average of 0.63. Thirty Wuyi rock tea germplasms were classified as three categories basing on the UPGMA cluster analysis. This study was of great significance for genetic research, breeding and resource protection of Wuyi rock tea.

Wuyi rock tea, germplasms, SRAP marker, genetic diversity, genetic relationship

S571.1；Q52

A

1000-369X(2017)01-078-08

2016-06-17

2016-08-09

國家質檢總局科技計劃項目（2013QK311）

夏法剛，男，講師，主要從事茶樹遺傳育種及品質分析。E-mail：sdxfm@163.com