海藻糖和胎牛血清對人乳腺細胞HBL-100低溫保存的影響

王美霞 梁瑋 葉萍 劉寶林

(上海理工大學生物系統熱科學研究所 上海 200093)

海藻糖和胎牛血清對人乳腺細胞HBL-100低溫保存的影響

王美霞 梁瑋 葉萍 劉寶林

(上海理工大學生物系統熱科學研究所 上海 200093)

建立高質量的生物樣本庫至關重要，低溫保存過程中保護劑的種類和濃度對樣本的冷凍效果有很大影響。本文以人乳腺細胞HBL-100為研究對象，在Me2SO含量10%的DMEM溶液中分別添加不同濃度海藻糖(0～0.3 mol/L)和不同體積分數FBS(20% ～60%)。采用逐步降溫法，先在-80℃冰箱中慢速降溫4 h，再快速投入到液氮中(-196℃)，凍存7 d后，在37℃水浴鍋中快速搖晃復溫。分別用臺盼藍法、CCK法和24 h貼壁率法檢測細胞的成活率，結果表明:與對照組相比，海藻糖和FBS對細胞的冷凍效果都有顯著影響。當海藻糖濃度一定時，FBS體積分數越高，細胞的冷凍效果越好，但不添加海藻糖時，FBS的作用不明顯;當FBS體積分數一定時，三種檢測指標在海藻糖濃度為0.2 mol/L時最優，且高濃度海藻糖可能會抑制FBS作用。考慮成本等因素，最適宜凍存人乳腺細胞HBL-100的凍存液為10%Me2SO+40% ～60%FBS+0.2 mol/L海藻糖。

低溫保存;存活率;海藻糖;胎牛血清

AbstractEstablishing a high-quality biobank is very important，but the cryoprotective agent(CPA)type and concentration have a considerable influence on the cryopreservation effect.In this paper，HBL-100 human breast cells were treated with 10%Me2SO combined with trehalose(0-0.3 mol/L)and fetal bovine serum(FBS;20%-60%)in Dulbecco′s modified Eagle′s medium(DMEM).Through gradual reduction of the temperature，the cells were cooled in a-80℃ freezer for 4 h and then quickly transferred into liquid nitrogen.After storing for 7 days， the cells were shaken quickly at 37 ℃.The cell survival rate was assessed using the trypan blue test， cell counting kit(CCK)assay， and the attached rations after 24 hours.The results show that， compared with the control group， the effects of the trehalose and FBS are very obvious.In particular， when the trehalose concentration is constant， a higher FBS volume fraction yields a better effect.The FBS has no significant effect without trehalose.Further， when the FBS volume fraction is constant， the optimal effect is obtained for 0.2 mol/L trehalose.A high trehalose concentration may weaken the effect of the FBS.Considering the cost and other factors，the most suitable CPAs for the cryopreservation of HBL-100 human breast cells are 10%Me2SO+40%-60%FBS+0.2 mol/L trehalose.

Keywordscryopreservation;viability;trehalose;fetal bovine serum

乳腺細胞的研究始于20世紀50年代，乳腺細胞可用來研究乳腺生長、發育和泌乳的分子機理，還可用于轉基因動物培養乳腺生物反應器的開發。近年來，建立健康細胞、組織樣本庫備受關注。保持樣本庫中健康細胞的活性，可以更加有效地保護細胞中的蛋白質、DNA、RNA等生物信息免受損傷，為進一步研究細胞的結構和發育提供了保證。但是，不同類型細胞和組織的適宜冷凍方法和條件存在較大差異，目前絕大多數的生物樣本庫不能很好的保持細胞的活性。所以，針對樣本庫中各種類型的細胞和組織，研究最有效的低溫保存方法具有重要意義。

二甲基亞砜(Me2SO)是目前凍存細胞最常用的保護劑，它可以降低保存液的冰點，減少胞內冰晶形成[1]。但毒性較大，單獨使用Me2SO不僅對細胞有損傷，而且不能很好的對細胞膜進行保護[2]。海藻糖是一種非滲透性保護劑，不僅能在細胞外形成高滲，減少胞內冰的形成，還具有較高的玻璃化溫度，易形成玻璃態，一方面避免了低溫對細胞膜蛋白質和脂質的損傷，另一方面將細胞膜的蛋白質分子支撐包裹起來，使之不易變形，抑制細胞膜融合，降低細胞膜的通透性[3]。有學者應用含不同濃度海藻糖的保護液，低溫保存肝癌細胞[4]、犬氣管[5]、卵巢癌細胞和宮頸癌細胞[6]及小鼠受精卵[7]，均取得了良好的保存效果。胎牛血清(FBS)也有助于細胞的冷凍保存，且在腸道腫瘤組織原代細胞[8]、牛成纖維細胞[9]等低溫保存中效果顯著。

因此，本實驗通過在Me2SO含量10%的細胞培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)中添加不同濃度的海藻糖(0 mol/L，0.2 mol/L，0.3 mol/L)及不同體積分數FBS(20%、40%、60%)，采用逐步降溫方式，研究了海藻糖和胎牛血清(FBS)對人乳腺細胞HBL-100冷凍效果的影響，為生物樣本庫的大量凍存提供了一種冷凍效果較好、操作簡單、成本低廉的冷凍方法。

表1 保護劑分組Tab.1 The groups of the cryoprotectants

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人乳腺細胞HBL-100(中科院上海生命科學研究院);胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶(賽默飛世爾生物化學制品有限公司);DMEM培養基(GIBCO公司);二甲基亞砜(Me2SO)(德國APPLICHEM公司);海藻糖(中國醫藥集團上海化學試劑公司);臺盼藍染色液(2X)(碧云天生物技術公司);CCK-8試劑盒(東仁化學科技有限公司);青霉素、鏈霉素(華北制藥)。

1.2 儀器與設備

超低溫冰箱(青島海爾特種電器有限公司);二氧化碳培養箱(上海博訊實業有限公司);低速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);程序降溫盒 (賽默飛世爾生物化學制品北京有限公司);酶標儀(英國柏楉有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 凍存液配制

配制11組不同的凍存液配方，如表1所示，配制前將Me2SO 4℃預冷[10]，將配制好的凍存液用0.22 μm針式濾器過濾除菌，用封口膜封住瓶口放置于4℃冰箱備用。

1.3.2 細胞培養

將人乳腺細胞HBL-100接種于含10%FBS、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL 的 DMEM(高糖)完全培養液中，置于37℃、5%CO2、70%濕度的培養箱中培養。取生長于對數期的細胞進行消化傳代，以備進行后續實驗。

1.3.3 細胞凍存

取生長處于對數期且細胞狀態良好的細胞進行冷凍。去除培養皿中的完全培養液，加入3 mL DHanks液清洗細胞兩次，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化，靜置1 min后，吸掉胰蛋白酶溶液，再加2 mL培養基終止消化。輕輕吹打皿壁，使細胞懸浮，然后吸入離心管中，1 500 r/min離心5 min，倒掉上清液，每組分別加入配制好的凍存液3 mL，輕輕吹打混勻，在4℃下平衡10 min后，再將3 mL細胞懸液均分加入3支凍存管中(即設置3個重復組)，并在各凍存管中標注細胞編號。使凍存管置于程序降溫盒中(降溫速率為1℃/min)，采用逐步降溫法，先放在-80℃冰箱中慢速降溫4 h(降溫速率為1℃/min)，再將凍存管投放到液氮中凍存7 d。

1.3.4 細胞復蘇

7 d后從液氮中取出凍存管，在37℃水浴鍋中快速搖晃進行復溫，1 500 r/min離心5 min，并倒掉上清液，然后分別加入1 mL培養基吹打均勻，制備成細胞懸液。

1.3.5 細胞檢測

1)臺盼藍染色法檢測細胞活力[11]

將凍存前和復溫后的細胞吹打混勻后，取50 μL于1.5 mL離心管中，再加入50 μL臺盼藍染液染色，混勻后靜止1 min，吸取少量混合液滴加于血球記數板蓋玻片旁，使液體進入記數室，細胞呈藍色為死細胞，呈無色透明狀為活細胞，統計四角大方格中的活細胞數，用式(1)計算細胞濃度:

根據細胞懸液體積計算總細胞數，并用式(2)計算細胞存活率:

2)CCK法檢測細胞活力[12]

每組實驗中，取復溫后的細胞懸液(1×105個/mL)置于96孔培養板中(邊緣孔用無菌PBS填充)，另加一組新鮮對照組(新鮮細胞且濃度接近于復蘇后細胞)，一組不含細胞的培養基組(調零空)，每組設有三個平行。每孔加入100 μL待測液，將培養板放在培養箱中預培養，然后向每孔加入10 μL CCK溶液，將培養板在培養箱內孵育1.5 h，用酶聯免疫檢測儀測定450 nm處的吸光度。按式(3)計算細胞活力[13]。

3)24 h貼壁率[14]

復溫后取等體積細胞懸液接種于培養皿中，加入8 mL培養基，置于二氧化碳培養箱中培養(37℃、5%CO2、70%濕度)，24 h后收集培養瓶中培養基，并用D-Hanks液(2 mL)清洗兩次，收集上清液，計數未貼壁細胞;然后用胰酶消化后加入培養基，1 500 r/min離心5 min，計數貼壁細胞，按式(4)計算細胞貼壁率:

1.4 數據分析

采用SPSS18.0軟件中ANOVA(Analysis of Variance)過程對數據進行方差分析、Duncan氏多重比較和雙因素分析。

2 結果與分析

2.1 FBS對人乳腺細胞HBL-100低溫保存效果的影響

凍存前，用臺盼藍染色得到新鮮細胞的存活率為(96.32±2.01)%。當海藻糖濃度分別保持恒定值時，不同體積分數FBS的細胞冷凍后細胞存活率和24 h貼壁率如表2所示。

由表2可以看出，三種檢測方法得到的結果趨勢一致。實驗組1～9、對照組2都與對照組1有顯著性差異(P＜0.05)，說明加入低溫保護劑(10%Me2SO、20% ～60%FBS和海藻糖)可以顯著提高細胞的存活率。實驗組2～9與對照組2相比也有顯著性差異(P＜0.05)，說明在10%Me2SO基礎上添加適當體積分數FBS和適宜濃度的海藻糖有助于提高細胞存活率。

當海藻糖濃度一定時，隨著FBS體積分數的增加，細胞的存活率、CCK存活率和24 h貼壁率均呈現增加趨勢，且有顯著性差異(P＜0.05);但當海藻糖濃度為0 mol/L和0.3 mol/L時，實驗1組和實驗7組的存活率、24 h貼壁率與對照組2相比略低，但差異性不顯著(P＞0.05)，即此時的20%FBS對細胞冷凍沒有促進作用;實驗1組和實驗2組的CCK存活率沒有顯著性差異(P＞0.05)，說明此時的20%FBS和40%FBS對細胞冷凍效果無差別。

2.2 海藻糖對人乳腺細胞HBL-100低溫保存效果的影響

當FBS體積分數分別保持恒定時，不同濃度海藻糖的細胞冷凍后細胞存活率、CCK存活率和24 h貼壁率如表3所示。

由表3可以看出，當FBS體積分數一定時，隨著海藻糖濃度的增加，細胞存活率、CCK存活率和24 h貼壁率都是先增加后減小，且差異顯著(P＜0.05);海藻糖濃度為0.2 mol/L時細胞低溫保存效果最好。20%FBS條件下，添加0.3 mol/L海藻糖的細胞存活率要低于0 mol/L海藻糖(P＜0.05)，CCK存活率和24 h貼壁率略高，但差異不顯著(P＞0.05);而40%FBS和60%FBS條件下，0.3 mol/L海藻糖的CCK存活率和24 h貼壁率要高于0 mol/L海藻糖，且差異顯著(P＜0.05)。說明高濃度海藻糖可能會抑制20%FBS的作用，但增加FBS體積分數一定程度上可以減少抑制作用。

2.3 雙因素方差分析結果

在A(海藻糖濃度)和B(FBS體積分數)兩個因素下，細胞存活率、CCK存活率和24 h貼壁率的雙因素方差分析結果如表4所示。

由表4可知，從整體上看，不同濃度海藻糖對HBL-100細胞存活率的影響是極其顯著的(P＜0.01)，對CCK存活率和24 h貼壁率的影響是顯著的(P＜0.05);不同體積分數FBS對HBL-100細胞的存活率和24 h貼壁率是極其顯著的(P＜0.01)，對CCK存活率影響是顯著的(P＜0.05);FBS與海藻糖

的交互作用不顯著(P＞0.05)。由最終結果來看，冷凍效果最好的凍存液組合是10%Me2SO+60%FBS+0.2 mol/L海藻糖，細胞存活率、CCK存活率和24 h貼壁率分別為(87.93±0.95)%、(91.82±0.62)%和(88.01±0.65)%。

表2 不同體積分數FBS的細胞冷凍后存活率、CCK存活率和24 h貼壁率(±s,n=3)Tab.2 The survival rate,CCK assay and the attached rations after 24 h of cells with different volume fraction of FBS(±s,n=3)

表2 不同體積分數FBS的細胞冷凍后存活率、CCK存活率和24 h貼壁率(±s,n=3)Tab.2 The survival rate,CCK assay and the attached rations after 24 h of cells with different volume fraction of FBS(±s,n=3)

注:用Duncan's multiple range test法進行多重比較，同列標有不同小寫字母表示組間差異顯著(P＜0.05)，標有相同小寫字母表示組間差異不顯著(P＞0.05)。

編號 海藻糖濃度/(mol/L) FBS體積分數/% 細胞存活率/% CCK存活率/% 24 h貼壁率/%對照組1對照組2——0.67±0.03h0.78±0.11h1.23±0.37g44.43±1.23f42.01±0.66g52.13±0.45f1 2 3 0 20 46.32±0.32f44.81±0.48f48.33±0.51f40 53.33±0.67e47.61±0.81f55.72±0.35e60 71.22±0.79b61.07±0.53d63.22±0.15d4 5 6 0.2 20 63.45±1.27d55.79±1.03e65.38±0.19c40 69.31±1.08b70.78±0.72b70.10±1.45b60 87.93±0.95a91.82±0.62a88.01±0.65a7 8 9 0.3 20 37.30±0.78g47.56±0.36f50.33±1.34f40 53.00±1.12e54.04±0.72e66.58±0.47c60 67.08±1.46c64.09±0.34c72.32±0.45b

表3 不同濃度海藻糖的細胞冷凍存活率、CCK存活率和24 h貼壁率(±s,n=3)Tab.3 The survival rate,CCK assay and the attached rations after 24 h of cells with different concentration of trehalose(±s,n=3)

表3 不同濃度海藻糖的細胞冷凍存活率、CCK存活率和24 h貼壁率(±s,n=3)Tab.3 The survival rate,CCK assay and the attached rations after 24 h of cells with different concentration of trehalose(±s,n=3)

注:用Duncan’s multiple range test法進行多重比較，同列標有不同小寫字母表示組間差異顯著(P＜0.05)，標有相同小寫字母表示組間差異不顯著(P＞0.05)。

編號 FBS體積分數/% 海藻糖濃度/(mol/L) 細胞存活率/% CCK存活率/% 24 h貼壁率/%1 4 7 0 20 46.32±0.32f44.81±0.48f48.33±0.51f0.2 63.45±1.27d55.79±1.03e65.38±0.19c0.3 37.30±0.78g47.56±0.36f50.33±1.34f2 5 8 0 40 53.33±0.67e47.61±0.81f55.72±0.35e0.2 69.31±1.08b70.78±0.72b70.10±1.45b0.3 53.00±1.12e54.04±0.72e66.58±0.47c3 6 9 0 60 71.22±0.79b61.07±0.53d63.22±0.15d0.2 87.93±0.95a91.82±0.62a88.01±0.65a0.3 67.08±1.46c64.09±0.34c72.32±0.45b

表4 細胞存活率、CCK存活率和24 h貼壁率的雙因素方差分析結果Tab.4 Results of double-factor analysis for the survival rate、CCK assay and the attached rations after 24 h

3 討論

3.1 檢測方法之間的關系

本實驗采用了三種方法檢測細胞的凍存效果。臺盼藍染色法是最常用的檢測細胞活性的方法[11]。實驗組的細胞存活率指標基本上能夠反映出海藻糖和FBS對細胞凍存效果的影響，但該方法操作誤差偏大，一般還需要用MTT法或CCK法檢測。有文獻顯示CCK-8法比傳統MTT法靈敏度高、操作簡便、結果準確可靠且重復性好[15]。CCK法的原理是試劑中的WST-8在電子載體的作用下能被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲臢物，用酶標儀在波長450 nm處檢測樣品吸光度[12]。實驗中CCK存活率結果從整體上看比臺盼藍檢測的存活率略高，可能是因為在CCK-8試劑染色過程中，一部分細胞雖然細胞膜受損，但因具有酶的活性會被檢測為“活細胞”。所以兩種方法聯合使用更能全面反映細胞活性。實驗組中24 h貼壁率與前兩種方法的結果相對應，它著重于檢測細胞復溫培養后的存活能力。

3.2 海藻糖和FBS的作用機制

實驗中用三種方法檢測的細胞存活率、CCK存活率和24 h貼壁率的結果是一致的。在不加任何保護劑凍存后，細胞幾乎全部死亡。而添加保護劑的實驗組冷凍效果都顯著(P＜0.05)。甘油是最早被使用的低溫保護劑，但有研究發現在同等條件下，甘油的冷凍效果遠低于Me2SO[9]。有學者研究出最適宜凍存人肝細胞的Me2SO濃度是10% ～12%[16]，人肝癌細胞Hep-G2為10% ～20%[17]，293T細胞為5%～10%[18]。實驗中以10%Me2SO為基礎凍存液，從實驗結果來看，單純的10%Me2SO并不能很好的凍存細胞，而加入不同濃度海藻糖和不同體積分數FBS對細胞冷凍效果影響顯著(P＜0.05)。表2顯示FBS體積分數越高，細胞的冷凍效果越好，這是因為FBS是培養細胞、保持細胞活性最重要的成分，還可以提供結合蛋白，結合有毒金屬和熱源物質，起解毒作用。表3顯示隨著海藻糖濃度的增加，存活率和24 h貼壁率先增加后減小，在0.2 mol/L時達到最大，說明海藻糖凍存細胞的確可以產生很好的效果，但需要控制濃度。濃度過高時，一方面會影響細胞膜表面酶的活性，減少Me2SO和FBS進入胞內，另一方面會使細胞過度脫水而死亡[19];濃度過低時又起不到保護細胞膜和蛋白質的作用。這一點與S.Blake等[4]的研究結果相吻合。實際上海藻糖的作用原理還包括:“水替代”假說、“玻璃態”假說、“優先排阻”假說，在紅細胞、血小板及生殖細胞等的離體長期保存中，均表現出獨特的功能[20]。表4結果顯示海藻糖和FBS的交互作用不顯著(P＞0.05)，說明它們相互之間的影響不大;但從最終結果來看，實驗6組的結果最好，說明它們協同作用可以產生更好的凍存效果。

在實際應用中，考慮到胎牛血清成本、細胞復溫后貼壁生長速度等因素，由表2可知:實驗5組、實驗3組和實驗9組比較，CCK存活率較高且差異顯著(P＜0.05)，臺盼藍檢測存活率和24 h貼壁率略低但差異不顯著(P＞0.05)。即10%Me2SO+40%FBS+0.2 mol/L海藻糖的凍存液組合也能實現很好的凍存效果。

3.3 凍存過程

目前大多數生物樣本庫采用-80℃冰箱與液氮罐保存樣本。液氮中可以實現長久保存[21]，因為在-196℃下細胞的生命活動幾乎完全停止。但凍存過程中的降溫速率要嚴格控制[22]。J.N.V.Reyes等[23]采用慢速降溫和玻璃化對牛胚胎冷凍保存進行研究，證明玻璃化方式效果最好。由于實驗條件等原因，本實驗只研究了逐步降溫法，為更進一步增強保存效果，還需要對不同降溫方式進行實驗研究。

本實驗為研究其他乳腺類細胞的低溫保存提供了一定的參考價值。但針對樣本庫中其他類細胞或組織，海藻糖是否適用、適宜濃度是多少、是否有更好的可替代保護劑、其他降溫方式的效果等問題都有待探索。

4 結論與建議

本實驗以人乳腺細胞HBL-100為研究對象，在10%Me2SO的DMEM中添加20%～60%FBS和0～0.3 mol/L海藻糖，研究海藻糖和FBS對細胞低溫保存效果的影響。采用臺盼藍染色法、CCK法和24 h貼壁率法檢測細胞活性，得出結論:當海藻糖濃度一定時，隨著FBS體積分數的增加，三種檢測指標都顯著增加;但當不添加海藻糖時，FBS的促進作用不明顯;當FBS體積分數一定時，細胞的存活率在海藻糖濃度為0.2 mol/L時最高。凍存液組合為10%Me2SO+60%FBS+0.2 mol/L海藻糖時的三種檢測指標最高。考慮到胎牛血清成本及復溫后細胞生長速度等因素，選擇40%FBS+0.2 mol/L海藻糖也能達到很好的冷凍效果。本文僅探討了一種細胞在兩種保護劑變化下冷凍效果的影響，對其他細胞或組織來說，保護劑的種類和用量有待進一步研究，以更好的完善生物樣本庫體系。

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Effects of Trehalose and Fetal Bovine Serum on Cryopreservation of HBL-100 Human Breast Cells

Wang Meixia Liang Wei Ye Ping Liu Baolin
(Institute of Biothermal Science and Technology， University of Shanghai for Science and Technology， Shanghai，200093，China)

R318.52;TB61+1

A

國家自然科學基金(50576059)資助項目。(The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.50576059).)

2016年10月18日

0253-4339(2017)05-0107-07

10.3969/j.issn.0253-4339.2017.05.107

劉寶林，男，教授，上海理工大學醫療器械與食品學院，13636524955，E-mail:blliuk@163.com。 研究方向:細胞、組織和器官的低溫保存、食品冷凍冷藏、食品藥品的冷凍干燥技術等。

About the corresponding authorLiu Baolin， male， professor， School of Medical Devices and Food Science， Shanghai University of Science and Technology， +86 13636524955，E-mail:blliuk@163.com.Research fields:the cryopreservation of cells， tissues and organs， food freezing and cold storage，food and drug refrigeration and drying technology.