OS-9、HIF1α在慢性阻塞性肺疾病患者中的表達及臨床意義

潘 坤 戴愛國 張澤明 趙學琴 陳 露 孟子卜

(河北大學附屬醫院呼吸內科，河北 保定 071000)

·呼吸、消化系統疾病·

OS-9、HIF1α在慢性阻塞性肺疾病患者中的表達及臨床意義

潘 坤 戴愛國1張澤明 趙學琴 陳 露 孟子卜

(河北大學附屬醫院呼吸內科，河北 保定 071000)

目的探討慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者及非COPD患者OS-9、低氧誘導因子(HIF1)α表達變化情況及其臨床意義。方法應用原位雜交法觀察OS-9 、HIF1α mRNA在氣管壁小動脈壁的表達，免疫組織化學法檢測肺血管壁OS-9、HIF1α蛋白質表達水平。結果COPD患者肺血管壁OS-9 mRNA及蛋白表達較非COPD組均降低(P<0.05)，COPD患者HIF1α mRNA及蛋白表達較非COPD組均升高，以蛋白升高更明顯。直線相關分析表明，OS-9蛋白與HIF1α蛋白表達呈負相關(r=-0.596，P<0.05)。結論OS-9或許可通過加強羥化酶的活性來調節HIF1α的表達，作為HIF1α的負相調控因子在COPD的發生發展中發揮作用。

OS-9；低氧誘導因子；慢性阻塞性肺疾病

慢性阻塞性肺疾病(COPD)的患病率占40歲以上人群的8.2%〔1〕，是 低 氧 性 肺 動 脈 高 壓的常見病因。低氧誘導因子(HIF)1α在低氧條件下發揮重要調節作用，人類很多疾病的發生都與HIF1α轉錄水平和蛋白表達水平變化有關。HIF1α在低氧大鼠及COPD患者肺動脈高壓形成過程中發揮重要作用〔2〕。脯氨酰羥化酶(PHDs)是HIF降解的催化酶，在其降解過程中發揮關鍵作用。體外培養細胞實驗發現OS-9可與HIF1α、PHDs結合，通過增強PHDs的酶活性促進HIF1α的降解。本實驗擬分析OS-9、HIF1α在COPD患者中的表達及臨床意義。

1 資料和方法

1.1一般資料 從湖南省老年醫院、常德市第一人民醫院選取新確診肺部腫瘤的患者28例，均行肺葉切除術。所有入選病例按照要求做胸部CT和肺通氣功能檢查，根據COPD診斷標準(2007年中華醫學會制定)分為COPD組和非COPD組。COPD組12例，男8例，女4例；年齡(60.5±6.8)歲；肺通氣功能分級：輕度5例，中度7例。非COPD組14例，男8例，女6例；年齡(58.4±8.7)歲；兩組年齡、性別、標本取材部位等方面均無統計學差異(P>0.05)。

1.2肺動脈壁中OS-9和HIF1α mRNA的檢測 將肺組織樣本在4%多聚甲醛/0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中固定2 h，制成石蠟切片，用胃蛋白酶處理石蠟切片以暴露mRNA核酸片段。 在38℃濕盒中預雜交2 h后，將雜交探針加入到樣品中。 38℃濕盒雜交16 h，干環境孵育雜交2 h，沖洗并進行封閉，將地高辛抗體加入到標本中，二氨基聯苯胺(DAB)及蘇木精染色，最后進行脫水并封閉觀察。根據血管壁的染色程度來判斷陽性及陰性表達結果，染色顏色越深，相對表達值越高。應用肺動脈壁圖像分析軟件測得肺血管壁平均吸光度，根據此定量資料比較兩組表達是否具有統計學意義。

1.3OS-9和HIF1α蛋白在肺動脈壁中的表達分析 將樣本用中性甲醛固定，按照常規程序制作石蠟切片。石蠟切片和過氧化物酶封閉溶液在室溫下孵育10 min，胰蛋白酶在37℃下孵育20 min以進行抗原修復，之后樣品在室溫下繼續溫育5 min。最后根據試劑盒的操作說明書滴加抗體，DAB、蘇木精依次染色，脫水封閉觀察血管壁。應用肺動脈壁圖像分析軟件測得肺血管壁平均吸光度，作為比較OS-9和HIF1α蛋白在兩組表達是否具有統計學意義的定量資料。

1.4統計學方法 應用SPSS16.0軟件進行t檢驗、直線相關回歸法。

2 結 果

2.1OS-9 mRNA及蛋白質在COPD組和非COPD組肺血管壁中的表達變化 非COPD組中，OS-9 mRNA及蛋白表達為陽性或強陽性，而在COPD組中OS-9 mRNA和蛋白的表達均顯著降低(均P<0.01)。見表1。

2.2HIF1α mRNA及蛋白質在COPD組和非COPD組肺血管壁中的表達變化 HIF1α mRNA的表達在非COPD組肺血管壁中為弱陽性，同時還觀察到一部分血管壁呈陽性，HIF1α mRNA在COPD患者中的表達呈陽性或強陽性，兩組差異有統計學意義(P<0.05)。 非COPD組血管壁HIF1α蛋白表達為陰性或弱陽性，COPD患者血管壁表達陽性或強陽性，兩組差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組OS-9、HIF1α表達比較

3 討 論

COPD是以不可逆氣流受限為特征的臨床疾病，患者一般存在呼吸衰竭并伴有低氧血癥，低氧是肺動脈高壓形成、肺血管重構最重要的功能性因素。HIF1α是機體適應低氧環境最重要的一類調控因子，在肺動脈高壓形成及肺血管重構中也發揮著重要作用〔3〕。本實驗說明低氧環境下COPD患者血管壁的HIF1α的翻譯、轉錄均呈上升趨勢，由此可推測出HIF1α表達增高可能與慢COPD的發病相關。

HIF1α蛋白降解有一個必要條件，即PHDs催化HIF1α氧依賴性降解區域兩個脯氨酸殘基羥基化。因此可知，可影響PHDs活性的調控因子均能間接影響HIF1α的表達。有學者體外實驗發現OS-9可同時與HIF1α及PHDs結合，形成包含三者的復合物，通過增強PHDs的酶活性進而促進HIF1α的羥基化，并通過泛素蛋白酶體途徑降解〔4〕。在同時轉染OS-9、HIF1α、PHDs的細胞中，OS-9的表達增強了羥化酶的催化活性，并進一步促使HIF1α經泛素蛋白酶體途徑降解。與此相反，在OS-9被抑制表達的細胞則發現HIF1α表達水平呈升高趨勢，且其下游靶基因表達也同時增強。本實驗發現OS-9 mRNA和蛋白質在非COPD組呈陽性/強陽性表達，COPD組表達均降低，而HIF1α在非COPD組呈弱陽性/陽性表達，COPD組表達升高，分析其原因可能是由于OS-9在COPD組表達降低，相對減弱了PHDs的酶活性，因此使得HIF1α蛋白表達增高。因此，OS-9在COPD患者中表達的動態變化可能影響了HIF1α的表達。OS-9或可通過影響PHDs的活性來間接調控HIF1α及其靶基因的表達，進而作為HIF1α的一個負相調節因子影響COPD的發病過程。OS-9由Su等〔5〕于1996年最早開始研究，其基因位于人染色體12q13-15區域，在人體組織細胞廣泛表達，骨肉瘤患者中表達最明顯。目前國內外關于OS-9功能的研究主要集中在其對非折疊蛋白通過內質網降解途徑降解中發揮重要作用〔6～9〕。有關其在低氧條件下表達降低的機制還需進一步研究。Sun等〔10〕通過在胰腺癌患者和體外細胞的試驗中發現，OS-9 mRNA和蛋白的表達可由一種長鏈非編碼RNA(ENST00000480739)上調表達，熒光分析實驗提示，這一機制可能是通過激活OS-9啟動子的表達而實現的。但是，低氧條件是是否由于ENST00000480739表達降低從而導致OS-9表達下降還需進一步研究。

1Zhong N，Wang C，Yao W,etal.Prevalence of chronic obstructive pulmonary disease in China：a large，population-based survey〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2007；176(87)：753-60.

2蔣永亮，聶 金，劉 蕾，等.ING4、PHDs以及HIF-1α在低氧性肺動脈高壓大鼠中的表達變化〔J〕.中國組織化學與細胞化學雜志，2014；23(2)：117-24.

3林 琳.老年慢性阻塞性肺疾病患者外周血HIF-1α、IL-18、Th17和Treg的表達及與肺功能的關系〔J〕.中國老年學雜志，2015；35(17)：4927-9.

4Baek JH，Mahon PJ，Kelly B，etal.OS-9 interacts with hypoxia-inducible factor 1 alpha and prolyl hydroxylases to promote oxygen-dependent degradation of HIF-1 alpha〔J〕.Mol Cell，2005；17(4)：503-12.

5Su YA,Hutter MC,Trent JM,etal.Complete sequence analysis of a gene (OS-9) ubiquitously expressed in human tissues and amplified in sarcomas〔J〕.Mol Carcinog，1996；15(4)：270-5.

6Tang HY,Huang CH,Zhuang YH，etal.EDEM2 and OS-9 are required for ER-associated degradation of non-glycosylated sonic hedgehog〔J〕.PLoS One，2014；9(6)：e92164.

7Schipanski A，Oberhauser F，Neumann M，etal.Lectin OS-9 delivers mutant neuroserpin to endoplasmic reticulum associated degradation in familial encephalopathy with neuroserpin inclusion bodies〔J〕.Neurobiol Aging，2014；35(10)：2394-403.

8Su W，Liu Y，Xia Y，etal.The Arabidopsis homolog of the mammalian OS-9 protein plays a key role in the endoplasmic reticulum-associated degradation of misfolded receptor-like kinases〔J〕.Mol Plant，2012；5(4)：929-40.

9Hosokawa N.OS-9 and XTP3-B：lectins that regulate endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD)〔J〕.Seikagaku,2011；83(1)：26-31.

10Sun YW，Chen YF，Li J，etal.A novel long non-coding RNA ENST00000480739 suppresses tumour cell invasion by regulating OS-9 and HIF-1α in pancreatic ductal adenocarcinoma〔J〕.Br J Cancer，2014；111(11)：2131-41.

〔2017-03-21修回〕

(編輯 袁左鳴)

R544

A

1005-9202(2017)19-4830-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.063

1 湖南省老年醫院 老年醫學研究所呼吸疾病研究室

戴愛國(1966-)，男，博士后，博士生導師，主任醫師，主要從事慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘等及疑難病的研究。

潘 坤(1981-)，女，碩士，主治醫師，主要從事慢性阻塞性肺病及哮喘研究。