人誘導多能干細胞用于亨廷頓病大鼠模型的移植治療

陳 波 劉智明 杜謝琴 余小祥

(武漢市第三醫院，湖北 武漢 430000)

人誘導多能干細胞用于亨廷頓病大鼠模型的移植治療

陳 波 劉智明1杜謝琴 余小祥

(武漢市第三醫院，湖北 武漢 430000)

目的探討用于亨廷頓病(HD)治療提供的藥物篩選模型。方法SD大鼠45只，分為正常對照組、毀損組、移植組三組，每組15只。正常組不予以處理，其余兩組均用奎寧酸(QA)腦內注射，移植組在QA毀損模型建立后進行人誘導多能干細胞(hiPSC)移植。hiPSC在大鼠腦內存活了7 w，通過阿撲嗎啡誘導旋轉實驗等行為學實驗，觀察各組大鼠運動功能情況；通過高十字迷宮、新環境抑制進食實驗，觀察各組焦慮類似的行為變化。結果與QA組相對比，觀察到hiPSC移植組大鼠運動功能得到改善，大鼠焦慮類似的行為明顯減少。hiPSC移植組大鼠的活動減少。結論hiPSC移植可以有效的改善HD大鼠的行為缺陷，hiPSC在治療神經退行性疾病特別是HD，是一種理想的多潛能干細胞來源。

誘導多能干細胞；亨廷頓病；細胞移植；運動和非運動功能檢測

亨廷頓病(HD)是一種以紋狀體和大腦皮質中型棘狀神經元大量丟失為特點的疾病，皮層神經元的丟失、變性會導致HD大鼠模型出現認知和情緒方面的改變〔1〕。盡管HD的致病基因和相關蛋白都已清楚，但確切的致病機制仍不清楚。研究表明，將興奮性毒性物質奎寧酸(QA)注射至紋狀體內可以模擬HD病理改變，進行移植治療的研究〔2，3〕。隨著細胞治療技術的發展，細胞移植被認為是HD治療最有前景的方法，尤其是人誘導多能干細胞(hiPSC)，通過將外源性轉錄因子(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)〔4〕導入人或動物體細胞誘導其逆分化而形成多能干細胞(iPSC)，具有多能分化潛能及自我更新能力。有研究〔5〕利用帕金森病(PD)患者自體來源的iPSC分化為多巴胺能神經元后移植至PD大鼠模型中，發現了明顯的行為學改善。Jeon等〔6〕使用HD患者自體來源的iPSC分化而成的神經前體細胞移植治療HD大鼠，獲得了明顯的行為學改善，并在宿主靶區探測到分化形成的γ-氨基丁酸(GABA)能神經元。本研究移植iPSC至QA毀損的HD模型大鼠，觀察其對大鼠運動和非運動功能的改善作用。

1 材料和方法

1.1實驗動物 所有的動物測試和訓練過程符合醫學倫理委員會批準，隨機分籠，每籠5只大鼠，21℃、65%的濕度飼養，晝夜節律為12 h，不限食水。分為三組，對照組15只不予以任何處理，QA毀損組：QA毀損的HD大鼠模型，hiPSC移植組：在建模成功后移植hiPSC。

1.2方法

1.2.1hiPSC用含標記基因病毒的轉導 用重組慢病毒轉導hiPSC，將第3代hiPSC以3×106個接種至T75培養瓶中，2 d后開始轉導，轉導的效率通過熒光顯微鏡檢測GFP和JRed基因的表達，轉導72 h后用含有嘌呤霉素的培養基培養。

1.2.2QA注射毀損紋狀體、誘導iPSC移植 大鼠腹腔麻醉后，除對照組外單次注射QA至單側紋狀體，7 d后將大鼠隨機分為兩組，一組移植hiPSC至紋狀體毀損側，另一組在毀損側紋狀體注射堿性磷酸鹽。

1.2.3運動功能測試

1.2.3.1阿撲嗎啡誘導的旋轉實驗 所有的大鼠按照1.0 mg/kg注射阿撲嗎啡，放置在有機玻璃圓筒中，每60 min記錄一次動物的旋轉運動，在移植后2、4、6 w分別測試一次。計算損毀側同側和對側身體旋轉次數：毀損同側的凈旋轉百分比=同側旋轉次數-對側旋轉次數/總旋轉次數×100%。

1.2.3.2懸掛實驗 大鼠咬住粗0.5 cm線，線距離地面高度為30 cm，記錄在60 s內跌落次數。每周測試3 d，每次3個實驗，取平均成績。在移植后1～6 w進行最后的運動測試結果。

1.2.4非運動測試

1.2.4.1高架十字迷宮實驗 測試前將每只大鼠放置在迷宮中適應5 min，實驗觀察員在距裝置2 m處觀察大鼠的行為。在預實驗完成后，將大鼠置于裝置的中間面對開放的臂，測試焦慮相關的行為，包括在開放和封閉的臂中所用總時間，在開放臂中花費更長時間預示焦慮程度低，測量總運動距離評價自發活動水平。

1.2.4.2新環境進食抑制實驗 將糖丸放置在新環境的中央，記錄每只大鼠離開角落的等待時間和達到并開始進食糖丸的時間，記錄喂食的情況，再將大鼠放回至原籠子中，記錄在5、15、30 min時大鼠攝入食物量，作為衡量攝食的動力。

1.2.5組織學分析 向腹腔內注射胺碘酮(100 mg/kg)和鹽酸賽拉嗪(5 mg/kg)，然后固定腦組織并稱重，用10%甲醛固定7 d后切除后腦，將前腦石蠟包埋后在顯微鏡下薄片切片機下連續切片，采用蘇木素-曙紅和0.5%紫羅蘭進行染色，蓋上玻片，在10倍的普通顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察。

1.3統計學分析 采用多重測量方差分析，所有的多重比較均采用圖基(tukey)事后比較法進行分析。

2 結 果

2.1阿撲嗎啡誘導旋轉實驗行為學分析 hiPSC移植組移植后2 w旋轉運動減少。只有QA毀損組隨著時間表現出旋轉運動次數不斷增加，hiPSC移植組表現出減少的趨勢，在所有的移植后階段均有統計學意義。見圖1。

2.2懸掛測試 在移植后6 w，QA毀損組和hiPSC移植組從線上跌落的潛伏期時間表現出預期的效果。與hiPSC移植組相比，QA毀損組在線上懸掛的時間更短(P<0.001)。見圖2。

圖1 阿撲嗎啡誘導旋轉實驗行為學分析

圖2 懸掛測試

2.3高架十字迷宮檢測大鼠的焦慮水平 在移植后3 w和QA毀損組相比，hiPSC移植組在封閉臂中花的時間更短。hiPSC移植組和對照組在焦慮程度上沒有區別。見圖3。

圖3 三組大鼠在封閉的短臂中的時間比較

2.4新環境進食抑制實驗中的焦慮類似的表現 QA毀損組表現出明顯的焦慮類似的表現。和QA毀損組大鼠相比，在新環境進食移植實驗中，hiPSC移植組大鼠在曠場實驗的儀器中進食等待時間〔(310.8±23.7)s〕明顯短于QA毀損組〔(438.7±25.8)s〕(P<0.01)。

3 討 論

HD可導致運動功能和精神方面的異常，目前研究主要通過動物模型探索改善行為的神經學方面機制，這些機制包括神經元的分化和替代治療、生長因子的釋放等，且都可能與損傷修復的過程有關。根據之前的研究發現，hiPSC移植至HD大鼠模型中可能緩解運動功能和認知功能的缺陷〔6〕，且hiPSC相對其他細胞移植手段，可以通過采用患者自體來源的細胞，重編程為hiPSC，避免移植后的免疫排斥反應，是一種極好的細胞來源〔7〕。本研究結果表明，在QA毀損組中，大鼠的功能缺失會隨著時間越來越嚴重，而將hiPSC移植至QA毀損的HD模型中沒有出現免疫排斥反應，由紋狀體退化導致的運動和探索功能得到了顯著的改善，運動功能的損害和情緒的缺陷很少。盡管可以觀察到探索的形式如站立、排泄的次數、恐懼的次數較少等改變，QA毀損的大鼠運動基線水平沒有限制大鼠的行為學改變，且相對于hiPSC移植組大鼠來說運動更加頻繁。在探索新環境中，大鼠通過測試站立和排泄次數提示情緒覺醒增多了，隨著過程的不斷熟練而情緒狀態覺醒減少。在移植hiPSC至QA毀損的大鼠后6 w，重建了情緒狀態的水平。

盡管hiPSC的移植治療呈現出極有前景的發展趨勢，但是在臨床上利用細胞替代治療HD正處于審查的階段，雖然理論上可行，細胞替代治療的局限性仍備受關注〔8〕，目前面臨的難題還有移植細胞的存活、理論的可行性和異體移植后的排斥反應等〔9〕。總之，向HD大鼠模型紋狀體內移植hiPSC可能緩解HD的運動和非運動缺陷，作為理想的藥物篩選模型及移植治療干預手段的運用和推廣有待更深層次的研究。

1Picconi B,Passino E,Sgobio C,etal.Plastic and behavioral abnormalities in experimental Huntington′s disease:a crucial role for cholinergic interneurons〔J〕.Neurobiol Dis,2006;22(1):143-52.

2Freeman TB,Hauser RA,Sanberg PR,etal.Neural transplantation for the treatment of Huntington′s disease〔J〕.Prog Brain Res,2000;127(3):405-11.

3Leavitt BR,van Raamsdonk JM,Shehadeh J,etal.Wild-type Huntingtin protects neurons from excitotoxicity〔J〕.J Neurochem,2006;96(4):1121-9.

4Takahashi K,Tanabe K,Ohnuki M,etal.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors〔J〕.Cell,2007;131(5):861-72.

5Novais A,Ferreira AC,Marques F,etal.Neudesin is involved in anxiety behavior:structural and neurochemical correlates〔J〕.Front Behav Neurosci,2013;7(1):119.

6Jeon I,Choi C,Lee N,etal.In vivo roles of a patient-derived induced pluripotent stem cell line(HD72-iPSC)in the YAC128 model of huntington′s diseaseInt〔J〕.J Stem Cells,2014;7(1):43-7.

7Haddad-Mashadrizeh A,Bahrami AR,Matin MM,etal.Evidence for crossing the blood barrier of adult rat brain by human adipose-derived mesenchymal stromal cells during a 6-month period of post-transplantation〔J〕.Cytotherapy,2013;15(8):951-60.

8Li Y,Nguyen HV,Tsang SH.Skin biopsy and patient-specific stem cell lines〔J〕.Methods Mol Biol,2016;1353(1):77-88.

9Edalatmanesh MA,Bahrami AR,Hosseini E,etal.Bone marrow derived mesenchymal stem cell transplantation in cerebellar degeneration:a behavioral study〔J〕.Behav Brain Res,2011;225(1):63-70.

〔2016-12-03修回〕

(編輯 郭 菁)

R39

A

1005-9202(2017)19-4758-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.029

湖北省自然科學基金資助項目(面上基金)(No.2014CFB450)；武漢市衛生計生委臨床醫學科研資助項目(No.wx15D21)

1 武漢市武昌醫院

劉智明(1968-)，男，主任醫師，博士，主要從事神經外科方面研究。

陳 波(1979-)，男，主治醫師，主要從事神經外科方面研究。