小鼠主動脈縮窄術后心肌水腫與水通道蛋白表達的相關性

黃 誠 呂洪臻 黃素琴 劉 穎 高 敏 韓扣蘭

(鹽城衛生職業技術學院，江蘇 鹽城 224005)

小鼠主動脈縮窄術后心肌水腫與水通道蛋白表達的相關性

黃 誠 呂洪臻 黃素琴 劉 穎 高 敏 韓扣蘭

(鹽城衛生職業技術學院，江蘇 鹽城 224005)

目的觀察小鼠心肌組織水通道蛋白(AQP)1的表達對心肌水腫的影響。方法采用主動脈縮窄法(TAC)建立小鼠心肌肥厚和水腫模型。實驗分為四組：①假手術組(Sham組)；②Sham+氯化汞(HgCl2)組，假手術后心肌注射0.3 mmol/L HgCl250 μl ；③手術組(TAC組)；④TAC+ HgCl2組，TAC術后心肌注射0.3 mmol/L HgCl250 μl。每組10只。術后2 w心臟超聲檢測各組小鼠心功能。計算各組小鼠心臟重量/體重比和心肌組織含水量。采用RT-PCR法檢測各組小鼠心肌組織中AQP1 mRNA表達。采用Western印跡法檢測各組小鼠心肌組織AQP1蛋白表達。結果TAC術后2 w，小鼠心肌組織發生明顯肥厚和水腫。同時，TAC小鼠心肌組織中AQP1 mRNA和蛋白的表達比Sham組顯著升高。心肌注射AQP1功能阻滯劑HgCl2可以降低TAC小鼠心臟重量/體重比和心肌組織含水量，改善TAC小鼠心功能。結論心肌組織中AQP1表達增加與TAC術后心肌水腫密切相關，阻滯AQP1功能可減輕心肌水腫，并改善心功能。

心肌肥厚；心肌水腫；水通道蛋白1；氯化汞

病理性心肌肥厚被公認為心血管疾病的獨立危險因素〔1〕。心肌細胞水腫是心肌肥厚發展過程中最常見的病理生理改變，長期慢性水腫會進一步加重心臟功能紊亂〔2〕。因此，減輕心肌水腫對抑制心肌肥厚的進一步發生發展及改善心臟功能具有重要的臨床意義。水通道蛋白(AQP)1廣泛表達于多種細胞類型，包括內皮細胞和心肌細胞〔3，4〕。在心肌組織中，AQP1主要表達于毛細血管內皮細胞膜及心肌細胞膜〔4，5〕。研究表明AQP1的表達與體外循環后心肌水腫發生密切相關〔6〕。但是，主動脈縮窄(TAC)導致的心肌水腫與AQP1的關聯尚未證實，另外，抑制AQP1的功能是否可以抑制心肌水腫和改善心臟功能也需要進一步的研究。本研究探討TAC術后AQP1的表達與心肌水腫的相關性。

1 材料與方法

1.1實驗材料 氯化汞(HgCl2，Sigma公司)，AQP1(Santa Cruz Biotechnology)。

1.2動物模型建立和分組 雄性C57BL/6小鼠40只，清潔級，體重20～25 g，8～10周齡，由南京醫科大學動物實驗中心提供〔合格證號：SCXK(蘇) 2002-0031〕。采用TAC法制備動物模型。4%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉，仰臥位固定小鼠，胸骨正中切口，分層打開縱隔腔，撥開胸腺，在心底部鈍性分離主動脈弓部，將鈍性27-G注射針頭(外徑0.4 mm)平行置于主動脈外壁，在頭臂干和左頸總動脈之間，用7-0手術絲線將針頭和主動脈弓一齊扎緊后將針頭移去，心肌注射0.3 mmol/L HgCl250 μl，關胸，術畢。假手術組(Sham組)采用相同處理，將7-0絲線置于主動脈弓相同位置不做結扎。術后小鼠常規喂養，于術后2 w心臟超聲檢測心功能后處死小鼠，取出心臟，計算心臟重量/體重比(HW/BW)，心臟標本置于液氮速凍，然后保存于-80℃冰箱待用。實驗分為四組：①Sham組；②Sham+HgCl2組，假手術后心肌注射HgCl2；③手術組(TAC組)；④TAC+HgCl2組，TAC術后心肌注射HgCl2。每組10只。

1.3心臟超聲檢測 術后2 w，小鼠經氣體麻醉后連接小動物超聲檢測設備，檢測心功能，取左室短軸觀、胸骨旁左室長軸觀，在二維影像指導下以M型超聲模式測量室間隔厚度(IVS)，左室后壁厚度(LVPW)，左室舒張末期內徑(LVEDD)和左室收縮末期內徑(LVESD)，計算左室射血分數(LVEF)和左室縮短分數(LVFS)。

1.4心肌組織含水量測定(干濕法測定) 每組取4只小鼠，分別稱心臟濕重，置80℃烤箱內48 h后稱干重，按以下公式計算心肌組織含水量：心肌組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.5RNA提取和real-time RT-PCR 心肌組織中的總RNA用Trizol試劑提取。cDNA合成采用Takara公司PrimeScriptTM RT reagent 試劑盒說明書步驟進行，根據Takara公司SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書步驟建立real-time PCR反應體系，在Eppendorf 公司Mastercycler ep realplex熒光定量PCR儀上檢測特異底物擴增情況。引物序列如下：AQP1正義鏈5′-TGCGTTCTGGCCACCACTGAC-3′，反義鏈5′-GATGTCGTCAGCATCCAGGTC-3′。 GAPDH正義鏈5′-CTGGAGAAACCTGCCAAGTA-3′，反義鏈5′-TGTTGCTGTAGCCGTATTCA-3′。相對基因表達采用2-△△CT法計算。

1.6Western印跡檢測 提取各組心肌組織總蛋白，進行蛋白定量后，樣品按比例加入5×SDS凝膠上樣緩沖液溶解，煮沸5 min。以20 μg蛋白進行上樣，電泳。300 mA恒流90 min將蛋白轉至PVDF膜；封閉液(1 g脫脂奶粉溶于20 ml PBST溶液)封閉1 h；一抗孵育(抗AQP1抗體1∶200；抗GAPDH抗體1∶5 000)4℃過夜。TBST清洗3次，每次10 min；二抗孵育(1∶2 000)，室溫1 h；TBST清洗3次，每次10 min；ECL發光液發光，Bio-Rad公司凝膠成像系統曝光、攝影、分析。

1.7統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組心功能比較 TAC術后2 w IVSD和LVPWD較Sham組明顯增厚，LVEDD明顯下降(P<0.01)，表明TAC術后2 w心臟出現向心性肥厚，同時LVEF和LVFS較Sham組明顯下降(P<0.01)，但未降低到心力衰竭水平(LVEF<50%)，表明TAC術后2 w心功能處于代償期。Sham組小鼠心肌注射HgCl2對心功能無明顯影響。另外，TAC組小鼠心肌注射HgCl2對TAC誘導的心肌肥厚無明顯影響，但能提高TAC小鼠LVEF和LVFS(P<0.05)，改善TAC小鼠心功能。見圖1，表1。

圖1 各組心臟大體觀察

組別IVSD(mm)IVSS(mm)LVEDD(mm)LVESD(mm)LVPWD(mm)LVPWS(mm)LVEF(%)LVFS(%)Sham組0.721±0.0391.103±0.1153.294±0.1591.983±0.1550.772±0.1221.321±0.17275.72±3.84141.63±1.841Sham+HgCl2組0.733±0.0511.157±0.1053.233±0.1921.979±0.1130.792±0.0981.351±0.14374.38±3.33742.30±1.151TAC組1.022±0.0962)1.399±0.0932)3.088±0.1731)2.098±0.1981.129±0.1182)1.388±0.10955.80±2.1372)29.19±3.2212)TAC+HgCl2組1.006±0.1252)1.363±0.1562)3.072±0.2581)2.082±0.1031.114±0.1432)1.351±0.12262.57±3.3312)3)34.76±2.7712)3)

與Sham組比較1)P<0.05，2)P<0.01；與TAC組比較：3)P<0.05，下表同

2.2各組HW/BW及心肌含水量比較 TAC組術后2 w HW/BW較Sham組顯著上升(P<0.01)，TAC小鼠心肌注射HgCl2能在一定程度上降低HW/BW。但是，Sham組小鼠心肌注射HgCl2后HW/BW無明顯差異(P>0.05)。同時，TAC術后2 w小鼠心肌含水量比Sham組顯著增加，心肌注射HgCl2能在一定程度上降低TAC小鼠心肌含水量。但是，Sham組小鼠心肌注射HgCl2后心肌含水量并無明顯差異。見表2。

2.3各組心肌AQP1 mRNA和蛋白表達比較 見圖2,表3。

表2 各組小鼠HB/BW和心肌組織含水量

圖2 各組心肌AQP1蛋白表達比較

組別AQP1mRNAAQP1蛋白Sham組1.000±0.0000.219±0.027Sham+HgCl2組1.027±0.0650.228±0.024TAC組1.700±0.2001)0.424±0.0141)TAC+HgCl2組1.667±0.1151)0.425±0.0131)

TAC術后2 w小鼠心肌AQP1 mRNA和蛋白表達均比Sham組顯著增加(P<0.05)，但是，心肌注射HgCl2對TAC誘導的AQP1 mRNA和蛋白表達增加無明顯影響。另外，心肌注射HgCl2對Sham組小鼠心肌AQP1 mRNA和蛋白表達也無明顯影響(P>0.05)。

3 討 論

研究表明與心肌肥厚相關的信號轉導通路主要集中在絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路，Ca2+及其依賴的信號通路和磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路，并且相互關聯〔7～9〕。然而，心肌細胞水腫是心肌肥厚發展過程中最常見的病理生理改變，長期慢性水腫會進一步加重心臟功能失調〔2〕。AQPs是一種跨膜通道蛋白，可以促進水分子的快速跨膜轉運，維持細胞內外滲透壓力的平衡。在人類和小鼠的心肌組織中可以檢測到AQP-1，-4，-7和-11 mRNA表達，而相應的蛋白水平只檢測到AQP1和AQP4的表達，Western印跡結果顯示在人類、大鼠及小鼠心肌組織中均有AQP1蛋白的表達〔10〕。在心肌組織中，AQP1主要表達于毛細血管內皮細胞膜以及心肌細胞膜〔4，5〕。應用AQPs基因敲除小鼠模型研究AQPs在心肌細胞水通透性中的作用，結果顯示AQP1敲除小鼠的心肌細胞水通透性下降，而不是AQP4敲除，說明在心肌細胞水通透性中起主要作用的是AQP1〔7〕。本研究說明小鼠TAC術后心肌水腫的發生與AQP1表達增高密切相關。雖然已有研究證實AQP1的高表達與心肌水腫的發生發展密切相關〔11〕，但是，AQP1是否可以作為心肌水腫的治療靶點尚待研究。綜上所述，心肌組織中AQP1表達增加與TAC后心肌水腫密切相關，阻滯AQP1功能可減輕心肌水腫，并改善心功能。因此，針對AQP1的靶向治療也許可以成為臨床上治療心肌水腫，抑制心肌肥厚進一步發展的新措施。

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〔2016-07-27修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R542.2

A

1005-9202(2017)19-4754-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.027

鹽城市衛生局科技計劃項目(No.YK2012040)

韓扣蘭(1968-)，女，碩士，教授，主要從事心力衰竭、呼吸衰竭機制研究。

黃 誠(1983-)，男，講師，主治醫師，主要從事心力衰竭機制研究。