大鼠肝癌發展過程MAPK信號轉導通路蛋白的動態變化

林冬靜 徐 冶 田洪燕 趙麗微 李 強 盧曉晶 陳 為

(吉林醫藥學院組織學與胚胎學教研室，吉林 吉林 132013)

大鼠肝癌發展過程MAPK信號轉導通路蛋白的動態變化

林冬靜 徐 冶1田洪燕 趙麗微2李 強3盧曉晶4陳 為5

(吉林醫藥學院組織學與胚胎學教研室，吉林 吉林 132013)

目的研究p38、JNK、ERK表達與肝癌發生的關系。方法雄性Wistar大鼠隨機分為空白對照組和模型組，空白對照組自由飲用食用水；模型組采用間斷性自由飲用二乙基亞硝胺(DEN)食用水的方法誘發肝癌模型，第0、5、9、12、14、16、18、20周取出肝臟，觀察其病理學改變；檢測p38、JNK及ERK1/2 mRNA和蛋白表達情況。結果模型組大鼠肝變硬，出現巨塊狀結節，癌細胞強嗜堿性，內質網擴張，線粒體腫脹，嵴斷裂，核染色質邊緣化；與空白對照組比較，模型組p38 mRNA表達水平9、12 w增加(P<0.05)，JNK mRNA表達水平從5 w增加至16 w，隨后表達水平顯著降低(P<0.05)，ERK mRNA表達水平18 w顯著降低(P<0.05)；模型組p-p38蛋白14、16、20 w表達均明顯降低(P<0.05)，p-JNK蛋白5 w、12～20 w表達明顯升高(P<0.05)，p-ERK1/2蛋白5 w表達明顯增加，18 w表達顯著降低(P<0.05)。結論DEN誘發大鼠肝癌發生中，MAPK信號中p38、ERK1/2激酶磷酸化水平降低而JNK激酶磷酸化水平增高，可能與內質網和線粒體關系密切。

肝細胞肝癌；二乙基亞硝胺；MAPK；信號轉導通路

原發性肝細胞肝癌(HCC)已成為發生率上升最快的惡性腫瘤，這與慢性病毒性肝炎和長期過量飲酒導致肝硬化關系密切〔1,2〕。在大多數已經形成的腫瘤組織中或者經體外實驗探討其成因，發現絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號轉導通路發揮重要調控作用。本研究采用二乙基亞硝胺(DEN)誘發大鼠肝癌模型，模擬人肝細胞癌發生，動態觀察該通路不同時相p38、JNK、ERK1/2蛋白表達情況，分析其所代表的三條通路與肝癌發生的關系。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選用清潔級雄性Wistar大鼠136只，5周齡，體質量140～160 g，由吉林大學基礎醫學院動物實驗中心提供，合格證號：SCXK(吉)2013- 0001。

1.2主要試劑和抗體 Trizol試劑為美國Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒為北京全式金生物技術有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒和增強化學發光(ECL)試劑盒均購自中國碧云天公司。p38、JNK、ERK和GAPDH引物由上海生工合成。p38多克隆抗體和p-p38單克隆抗體分別購自中國凱基生物科技發展有限公司和美國Santa cruz公司，JNK抗體購自美國Abcam公司，p-JNK抗體購自美國Santa cruz公司，ERK1/2和p-ERK1/2多克隆抗體購自中國沈陽萬類生物。HRP標記羊抗兔二抗和β-actin抗體購自中國天津三箭公司，其余試劑為國產分析純。

1.3主要儀器 550型酶標儀和Western電泳槽均為美國Bio-Rad開發公司產品；轉膜儀為Tianon公司產品，電泳儀為中國六一儀器廠產品，中國Genesys凝膠成像分析系統采集蛋白表達圖像并進行密度分析，D-78532型臺式低溫超速離心機為日本Hettich公司；JEM-1200EX型透射電鏡為日本Hitachi公司產品；凝膠圖像分析儀為中國國瑞實驗儀器公司產品。

1.4大鼠肝癌模型的建立 適應性飼養7 d，隨機分為：①空白對照組(0 w)16 只：飲用滅菌食用水；②模型組120 只：自由飲用滅菌食用水配置0.01%DEN(美國Sigma公司，其純度為99.9%)溶液，隔天更換1次，連續5 w 后，改飲滅菌食用水3 w，再繼續飲用含0.01%DEN溶液12 w 停藥。造模過程觀察各組大鼠精神狀態、體重變化。

1.5取材 誘癌開始后第0、5、9、12、14、16、18、20周分批處死大鼠，空白對照組2只，模型組3只。取出肝臟，觀察肝臟外觀(大小、色澤、質地、有無結節形成等)，取新鮮肝組織迅速用0.9%生理鹽水漂洗，未出現癌灶者取部分肝組織，出現癌灶者取肉眼癌灶及距癌灶邊緣1 cm 癌旁組織，均用10%中性甲醛固定，制備石蠟切片；另取一部分組織置于戊二醛和鋨酸中雙重固定，透射電鏡觀察肝細胞的超微結構；部分組織于-80℃保存。

1.6HE染色 石蠟切片，經脫蠟、脫水、漂洗、蘇木精染色、分化、漂洗、伊紅染色、再脫水、透明、封片。光鏡下觀察，照相。

1.7RT-PCR技術檢測基因mRNA表達 按TRIzol試劑盒說明書提取肝組織總RNA，檢測總RNA濃度，取RNA樣品，按RT-PCR試劑盒說明書操作。PCR產物經1.5%瓊脂糖電泳后在凝膠成像系統下觀察圖像并拍照。目的基因的mRNA相對含量=目的基因密度/GAPDH密度。

1.8Western印跡技術檢測蛋白表達 取相同質量的肝組織加入含PMSF的蛋白裂解液，冰上快速組織超聲破碎，12 000 r/min離心15 min取上清，采用BCA法測定蛋白濃度。等量等體積的總蛋白經12%分離膠和4%濃縮膠進行SDS-PAGE電泳，電泳后將蛋白轉印至PVDF膜。用5%脫脂奶粉搖床緩慢封閉約1.5 h后分別加入適當稀釋比例的ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、JNK、p-JNK抗體，4 ℃過夜，第2天加入二抗孵育1 h，PBST漂洗，ECL顯影。采用Genesys凝膠成像分析系統采集圖像并用圖像分析軟件對所得條帶進行相對定量分析。目的蛋白表達的相對含量=目的蛋白表達密度/β-actin表達密度。

1.9統計學方法 應用SPSS13.0 統計軟件進行t檢驗、方差分析，q檢驗，秩和檢驗。

2 結 果

2.1DEN對大鼠一般狀態的影響 空白對照組大鼠未出現死亡，精神狀態良好，體重增加。模型組大鼠在造模3 w時死亡1只，隨著飲用DEN溶液時間延長，大鼠出現嗜睡，精神萎靡，毛色暗，粗糙，不整齊，伴有不潔；9 w后體重有所降低，14 w進食量、進水量均明顯減少，尿液發黃，糞便量減少，體重繼續下降；18 w時大鼠多聚集蜷曲，很少活動，1例死亡，解剖后見明顯肝癌結節，20 w時，懶動體輕，對一般的物理刺激反應極差。

2.2DEN對大鼠肝臟大體形態和病理學改變的影響 見圖1～圖3。肉眼見空白對照組大鼠肝臟呈現淡紅色，具有光澤度，質地柔軟而富有彈性，表面光滑，邊緣整齊，5、9 w模型組大鼠肝臟顏色略暗，顏色加深，表面光澤度較空白對照組差，12 w時肝表面出現灰白色結節，大小不一，數量不等，散在分布，肝組織邊緣鈍化，體積略有下降，20 w肝組織變硬，色淺，表面出現巨塊狀結節，彌漫分布。光鏡下可見：空白對照組0 w 大鼠肝小葉結構完整，肝細胞排列整齊，核清晰，大小一致且分布均勻，肝細胞索圍繞中央靜脈，呈放射狀分布，肝竇清晰；模型組大鼠：5 w肝小葉結構基本完整，9 w 部分肝細胞呈氣球樣變，小葉內可見灶性壞死伴炎性細胞浸潤，同時逐漸出現纖維組織增生及肝細胞再生；12～16 w 肝小葉結構破壞，出現纖維組織間隔，形成典型的假小葉結構；18～20 w 癌變期的癌細胞異型性明顯，胞核增大，胞質少，嗜堿性增加，可見較多的單核細胞和核分裂相，部分可見癌細胞浸潤周圍組織，侵犯血管，并有灶內出血、壞死現象。超微結構：空白對照組0 w 大鼠的肝肝細胞內線粒體、高爾基復合體、粗面內質網、滑面內質網和糖原都較為豐富，可見溶酶體，線粒體雙層膜和嵴，各時間段的模型組肝細胞的線粒體、高爾基復合體、粗面內質網、滑面內質網、溶酶體、線粒體雙層膜等均隨著給藥時間的增加而出現不同程度的細胞器結構破壞，20 w 時可見內質網擴張，線粒體腫脹，嵴斷裂，雙層膜結構破壞，部分線粒體形成電子透亮區，核染色質邊緣化，部分細胞器外側可見雙側膜包裹，形成自噬體。

2.3DEN對MAPK通路分子mRNA表達水平的影響 飲用DEN食用水溶液，p38 mRNA表達水平從9 w開始明顯升高，直至12 w，在18 w表達水平下降(P<0.05)；JNK RNA表達水平5 w、12 w 增加，14～18 w表達水平降低(P<0.05)。ERK1/2 mRNA表達12 w增加，18 w表達降低(P<0.05)，表明DEN誘發腫瘤發生中p38、JNK、ERK基因mRNA表達均有改變，并且三者間的這種改變不同步，見表1，圖4。

2.4DEN對MAPK通路分子蛋白表達水平的影響 與空白對照組比較，0～9 w p-p38蛋白表達升高，至14、16、20 w 降低，18 w時表達升高(P<0.05)；p-JNK蛋白在5～20 w時表達明顯升高(P<0.05)；JNK總蛋白表達水平無顯著改變(P>0.05)；p-ERK1/2蛋白表達水平5 w升高，18 w 降低(P<0.05)，提示DEN誘發大鼠肝癌發生過程p38和JNK、ERK1/2蛋白發生動態改變，主要在磷酸化水平發揮重要調節作用。見圖5，表2。

圖1 各組肝臟大體形態變化

圖2 各組肝組織病理學改變(HE，× 200)

圖3 各組肝細胞超微結構(×6 500)

組別p38JNKERK1/2空白對照組1±0.531±0.491±0.51模型組5w1.49±0.612.05±0.741)0.85±0.0891)模型組9w2.32±0.831)2.65±0.751)1.08±0.21模型組12w2.88±0.91)6.02±1.321)1.40±0.261)模型組14w1.41±0.442.26±0.681)0.94±0.082模型組16w0.75±0.092.54±0.661)1.03±0.19模型組18w1.54±0.641)0.43±0.0761)0.29±0.071)模型組20w1.96±0.581)1.64±0.520

與空白對照組比較：1)P<0.05，下表同

1～8:空白對照組、模型組5、9、12、14、16、18、20 w，下圖同圖4 各組肝組織p38、JNK、ERK1/2 mRNA表達

圖5 各組p38、JNK、ERK1/2磷酸化蛋白表達水平

組別p-p38/p38pJNK/JNKpERK1/ERK1pERK2/ERK2空白對照組1.12±0.511.18±0.461.23±0.380.98±0.25模型組5w1.76±1.051.53±0.361)1.41±0.261)1.35±0.891)模型組9w2.46±1.291.12±0.401.03±0.170.78±0.26模型組12w1.98±0.871.47±0.411)0.95±0.230.48±0.171)模型組14w1.63±0.981)1.34±0.281)0.54±0.461)0.75±0.34模型組16w0.91±1.421)1.59±0.321)0.83±0.080.56±0.0781)模型組18w10.77±4.861)1.45±0.351)0.38±0.0221)0.35±0.0191)模型組20w0.76±0.041)1.45±0.291)1.21±0.530.61±0.23

3 討 論

信號轉導通路MAPK是HCC發展關鍵通路之一，MAPK信號主要有ERK、JNK、p38-MAPK三條途徑，當它們受到EGF、VEGF、PDGF、HGF等生長因子刺激，各個信號分子殘余的酪氨酸被磷酸化，活化，進而發揮生物調節功能〔3～7〕。

肝癌動物模型多采用DEN作為誘癌劑〔8〕。DEN是一種DNA羥化物，具有中毒性和致癌性雙重效應，有很高的致癌率，特別對于肝臟，最終形成肝硬化伴發HLL。有研究表明DEN誘發HCC時，第1～4周為肝炎、肝纖維化期，為中毒性肝炎表現；第5～12周為肝硬變期；第14～18周為癌變期，這與預后較差的人類HCC特點較為相似〔9〕。本研究顯示DEN誘發大鼠HCC發生中，MAPK信號中p38、ERK1/2激酶磷酸化水平降低而JNK激酶磷酸化水平增高，可能與內質網和線粒體關系密切。本研究采用大鼠間斷性自由飲用DEN食用水給藥途徑，模擬人原發性肝細胞肝癌的發生，這樣極大減少其他給藥途徑對大鼠的應激反應，利于后續實驗觀察和檢測。同時結合原發性肝細胞肝癌形成的關鍵時期(肝炎、肝纖維形成，中毒性肝炎、肝硬變、癌變)進行肝腫瘤組織的定點取材，動態觀察MAPK信號轉導通路中各種調控因子的變化，補充在已經形成的腫瘤組織中或者是在體外細胞株中得到的結果，為后續開展體外實驗MAPK調控腫瘤細胞生物學特征機制時提供依據。

1Schütte K,Bornschein J,Malfertheiner P.Hepatocellular carcinoma-epidemiological trends and risk factors〔J〕.Dig Dis,2009;27(2):80-92.

2Hernandez-Gea V,Toffanin S,Friedman SL,etal.Role of the microenvironment in the pathogenesis and treatment of hepatocellular carcinoma〔J〕.Gastroenterology,2013;144(3):512-27.

3El-Serag HB,Kanwal F,Davila JA,etal.A new laboratory based algorithm to predict development of hepatocellular carcinoma in patients with hepatitis C and cirrhosis〔J〕.Gastroenterology,2014;146(5):1249-55.

4El-Serag HB,Alsarraj A,Richardson P,etal.Hepatocellular carcinoma screening practices in the department of veterans affairs:findings from a national facility survey〔J〕.Dig Dis Sci,2013;58(11):3117-26.

5毛 華,黃純熾,趙敏芳.p38MAPK信號傳導通路調控VEGF誘導肝癌細胞黏附作用〔J〕.世界華人消化雜志,2006;14(8):778-83.

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8程延安,袁利超,黨雙鎖,等.間斷小劑量DEN誘發大鼠肝癌模型研究〔J〕.腫瘤防治雜志,2005;12(11):806-8.

9張志敏,王 閣,陳 川,等.改進性DEN誘發大鼠肝癌模型的建立與病理形態學研究〔J〕.第三軍醫大學學報,2007;29(12):1164-7.

〔2016-07-27修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R735.7

A

1005-9202(2017)19-4739-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.021

吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目(No.2013-357)

1 基礎醫學院 2 病理學教研室 3 免疫學教研室 4 生物化學與分子生物學教研室 5 檢驗學院

林冬靜(1977-)，女，講師，在讀博士，主要從事腫瘤病理生物學研究。