小劑量IL-17A對糖尿病腎病大鼠腎功能的保護作用

白彝華 楊 敏 蔣紅櫻 王劍松 王家平

(昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院腎內科，云南 昆明 650101)

小劑量IL-17A對糖尿病腎病大鼠腎功能的保護作用

白彝華 楊 敏 蔣紅櫻 王劍松1王家平2

(昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院腎內科，云南 昆明 650101)

目的探討小劑量白細胞介素(IL)-17A對糖尿病大鼠腎臟的保護作用。方法雄性SD大鼠45只，隨機分為正常對照組、糖尿病腎病(DN)組及IL-17A組。DN組及IL-17A組均以高脂高糖飲食聯合腹腔注射鏈脲佐菌素建立DN大鼠模型。IL-17A組給予小劑量IL-17A重組蛋白，連續(xù)給藥12 w后，下腔靜脈取血，檢測糖化血紅蛋白(HbA1c)、肌酐、尿素氮等；水平代謝籠收集各組大鼠24 h尿液，測定大鼠24 h尿蛋白；實時熒光定量PCR檢測腎組織炎癥因子表達；Western印跡測定IL-17A蛋白表達情況。結果DN組及IL-17A組尿蛋白、HbA1c、肌酐、尿素氮水平均顯著高于正常對照組，IL-17A組均顯著低于DN組(均P<0.05)。DN組在注射IL-17A后促炎因子表達顯著減少，抑制性炎癥因子表達顯著降低。DN模型大鼠IL-17A蛋白顯著減少。結論IL-17A具有改善DN大鼠腎功能作用，并有可能逆轉DN，是治療DN的有效靶點。

糖尿病腎病；白細胞介素17A；炎癥反應

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，是全球范圍內導致終末期腎病的主要病因〔1〕。目前關于腎小管間質病變機制的作用逐步得到關注〔2〕。大量研究顯示，炎癥反應在糖尿病慢性腎病進程中扮演重要角色，其嚴重程度部分取決于各種白細胞介素(IL)家族因子間的相互作用，既可以介導炎癥反應又可以調節(jié)炎癥反應〔3～5〕。IL-17A是由CD4+T細胞、自然殺傷細胞及中性粒細胞產生，具有調節(jié)和募集中性粒細胞的作用。近來研究顯示IL-17A在銀屑病、動脈粥樣硬化、強直性脊柱炎等疾病中可通過抑制炎癥反應而發(fā)揮積極作用〔6，7〕。但目前關于IL-17A在DN進展中發(fā)揮怎樣的作用尚無相關報道。本實驗擬研究IL-17A對DN大鼠腎臟的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1材料 清潔級雄性D大鼠45只，體重160～190 g，平均(175.1±6.9)g，8周齡，由維通利華動物技術公司提供，大鼠飼養(yǎng)和實驗嚴格要求進行，自由進食水，光照周期12 h。鏈脲佐菌素(STZ)為Sigma公司，IL-17A重組蛋白為Biovision公司，抗GAPDH、抗IL-17A抗體為Abcam公司，CFX96型熒光定量基因擴增儀(Bio-Rad)，ND 2000C型紫外分光光度計(Thermo Scientific)，BS-380型生化分析儀(邁瑞)。

1.2實驗分組與建立DN模型 45只雄性SD大鼠適應性飼養(yǎng)1 w后隨機分為正常對照組、DN組及IL-17A組。IL-17A組及DN組給予高脂高糖飲食1個月誘導胰島素抵抗，后采用腹腔一次性注射STZ溶液(150 mg/kg)建模。正常對照組給予等量枸櫞酸緩沖液。注射后1 w檢測大鼠空腹血糖，血糖高于11.2 mmol/L即建模成功。該模型具有高血脂、胰島素抵抗和典型DN等特點。

1.3IL-17A給藥 STZ注射后1 w，模型制作成功后，治療組給予腹腔注射IL-17A重組蛋白(10 ng/次，48 h/次)，連續(xù)注射12 w；正常對照組和DN組給予注射等量磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.4標本采集 藥物注射12 w后，將大鼠放入水平代謝籠中收集各組大鼠24 h尿液，酶聯免疫吸附(ELISA)法測24 h尿微量蛋白；心臟取血后處死大鼠，測定血中糖化血紅蛋白(HbA1c)、肌酐、尿素氮；取出腎臟立即放入液氮中，置于-80℃冰箱凍存留做檢測。

1.5RT-PCR 應用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應法測定大鼠腎組織中炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6的表達情況。Trizol 法提取組織總RNA。引物序列IL-6上游：5′-ACA ACC ACG GCC TTC CCT ACT T-3′,下游：5′-CAC GATTTC CCA GAG AAC ATG TG-3′;TNF-α上游：5′-AAG CCT GTA GCC CAC GTC GTA-3′,下游：5′-GGC ACC ACT AGT TGG TTG TCT TTG-3′;IL-10上游：5′-GCT CTTA CTG ACT GGC ATG AG-3′,下游：5′-CGC AGC TCT AGG AGC ATG TG-3′;GAPDH上游：5′-GTG TAA CCC ATA ACC CCC AAG A-3′,下游：5′-CAC CAG CAG ACC CTC AAG C-3′。逆轉錄法按照M-MLV試劑盒(Invitrogen)操作程序進行。擴增反應體系10 μl，反應條件為預變性：94℃，2 min；變性：94℃，10 s；退火：60℃，20 s；延伸：72℃，15 s，進行39個循環(huán)，循環(huán)結束后72℃ 10 min總延伸。選擇管家基因GAPDH作為內標，對目的基因均一化。目的基因相對表達量采用2-ΔΔCT法，將正常對照組標本內目的基因表達水平設為1，對DN組及IL1-7A組標本內目的基因表達水平進行標準化。

1.6Westem印跡法 稱取100 mg -80℃保存的腎組織加入適量PBS，加入適量組織蛋白裂解液，用超聲波細胞破碎儀裂解組織后，每10 min漩渦振蕩器振蕩1次；10 000 r/min離心30 min，取上清液，用BCA法測定蛋白濃度。定量后各取樣本量30 μg，10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，電壓100 V，電泳2 h。濕式轉膜法將蛋白轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，電壓80 V，時間 1 h。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h。4℃冰箱內孵育一抗(1∶3 000)過夜；TBST洗膜后室溫下二抗(1∶5 000) 孵育1 h，TBST洗膜后與ECL發(fā)光試劑反應，于凝膠成像分析儀上進行檢測。通過Image J軟件計算各條帶灰度值，以GAPDH作為內參進行標準對照。

1.7統(tǒng)計學分析 用SPSS17.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1各組大鼠一般情況 STZ注射后5 d，3只大鼠可能因血糖過高致死。至實驗結束共存活大鼠42只，正常對照組15只，IL-17A組14只，DN組13只。正常對照組大鼠精神好，毛發(fā)光澤，食欲佳，體重持續(xù)增加；IL-17A組精神一般，毛發(fā)光澤度差，食欲可，體重增加；DN組精神差，毛色無光澤，明顯出現多飲、多食、多尿表現，行動遲緩。

2.2各組大鼠尿蛋白、HbA1c、肌酐、尿素氮水平對比 與正常對照組比較，DN組及IL-17A組尿蛋白、HbA1c、肌酐、尿素氮水平均顯著升高(P<0.05)；與DN組比較，IL-17A組尿蛋白、肌酐、尿素氮水平均顯著降低(P<0.05)，HbA1c水平有所下降，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠相關指標水平比較

與正常對照組比較：1)P<0.05；與DN組比較：2)P<0.05

2.3大鼠腎臟炎癥因子的表達 與正常對照組(1.2±0.8，1.2±0.8，0.77±0.24)比較，DN組(15.1±1.2，17.0±1.4)和IL-17A組(8.2±1.0，6.3±0.8)IL-6、 TNF-α表達顯著升高，DN組IL-10顯著降低(0.41±0.06)，IL-17A組IL-10顯著升高(1.42±0.31，均P<0.05)；與DN組比較，IL-17A組IL-6、 TNF-α表達顯著降低，IL-10顯著升高(均P<0.05)。

2.4大鼠腎臟IL-17A蛋白表達情況 與正常對照組(0.52±0.09)相比，DN組IL-17A蛋白(0.23±0.06)顯著降低，IL-17A組顯著升高(0.72±0.04，P<0.05)；與DN組比較IL-17A組IL-17A蛋白顯著升高(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟IL-17A蛋白的表達

3 討 論

20%～40%2型糖尿病患者會并發(fā)DN〔8〕。DN是糖尿病患者嚴重的微血管并發(fā)癥之一，是致殘、致命性的并發(fā)癥，可導致患者慢性腎功能不全。早期、晚期患者均可出現蛋白尿，嚴重者可出現尿毒癥。病變腎臟組織病理特點表現為腎小管和腎小球的基底膜增厚，細胞外基質積聚增多以及連續(xù)性的系膜增生〔9〕。依靠嚴格的胰島素治療，嚴格控制患者飲食中蛋白質的攝入量，采取低蛋白飲食，控制血壓等措施可以延緩DN的發(fā)生。

自Bohle等〔10〕發(fā)現DN患者腎組織中存在巨噬細胞浸潤后，越來越多的證據顯示，炎癥在DN發(fā)展進程中發(fā)揮重要作用。Navarro等〔11〕發(fā)現Ⅱ型糖尿病患者血清中TNF-α水平顯著高于正常人群，是DN臨床的獨立相關性標志物。另外炎癥因子單核細胞趨化因子-1〔12〕、細胞間黏附分子-1〔13〕、IL-6〔14〕等均證明與DN的發(fā)生與發(fā)展有關。

IL-17家族蛋白已被證實在關節(jié)炎等炎性、纖維化疾病中發(fā)揮負性調控炎癥因子作用〔15〕。IL-17家族細胞因子能誘導多種細胞因子表達，如IL-6、IL-1、TGF-β、TNF-β、TNF-α及趨化因子IL-8、MCP-1等。通過這些細胞因子及趨化因子，IL-17在治療類風濕關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、移植排斥反應及牛皮癬等發(fā)揮一定的作用。IL-17家族各成員有不同的表達部位和方式，T細胞激活后分泌IL-17A、IL-17F，并在炎癥反應期間有顯著的上調；IL-17B表達于外周組織和免疫器官；IL-17C在炎癥反應期間表達會有上調，但在一般情況下呈低表達狀態(tài)；IL-17D在神經系統(tǒng)和骨骼肌中高表達，IL-17F在多種外周組織中都成低表達狀態(tài)〔16〕。IL-17A的作用是把雙刃劍，一方面可以抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生〔17〕，另一方面在載脂蛋白E敲除小鼠中IL-17A缺乏又會加速不穩(wěn)定動脈粥樣斑塊的形成〔18〕。而關于IL-17A在腎臟病中的作用目前尚不明確。

本研究結果說明DN大鼠腎組織中IL-17A蛋白減少，炎癥反應加劇，通過注射IL-17A重組蛋白，炎癥減輕，腎功能得到改善。

Tong等〔19〕研究發(fā)現與野生型糖尿病模型小鼠相比，IL-17A基因敲除糖尿病模型小鼠的蛋白尿程度以及腎間質的損害相對較輕，說明抑制IL-17的表達將改善DN的癥狀，甚至可能實現DN的轉歸。目前，有一種新興藥物IL-17A抑制劑，即Secukinumab，它是一種重組、高親和性、人免疫球蛋白G1κ單克隆抗體，能夠選擇性地與IL-17A結合從而中和IL-17A的作用，目前處于Ⅲ期臨床試驗階段。Ⅱ期臨床試驗結果顯示其對銀屑病、強直性脊柱炎、類風濕關節(jié)炎有明顯療效〔20〕。而目前關于抑制IL-17A或IL-17F對于DN的作用還無相關報道。

本研究結果表明，IL-17A的缺乏會促進腎病的進展，加劇糖尿病模型大鼠的病情；但是給予糖尿病模型大鼠低劑量的IL-17A，能夠有效治療大鼠DN模型的腎臟炎癥反應，并有可能預防和逆轉DN，從而成為治療DN的有效靶點。

1Verhave JC，Bech AP，Wetzels JF，etal.Hepatocyte nuclear factor 1beta-associated kidney disease：more than renal cysts and diabetes〔J〕.J Am Soc Nephrol，2016；27(2)：345-53.

2Anil KP，Welsh GI，Saleem MA，etal.Molecular and cellular events mediating glomerular podocyte dysfunction and depletion in diabetes mellitus〔J〕.Front Endocrinol (Lausanne)，2014；5(1)：151.

3Baker RG，Hayden MS，Ghosh S.NF-kappaB，inflammation，and metabolic disease〔J〕.Cell Metab，2011；13(1)：11-22.

4Bangstad HJ，Seljeflot I，Berg TJ，etal.Renal tubulointerstitial expansion is associated with endothelial dysfunction and inflammation in type 1 diabetes〔J〕.Scand J Clin Lab Invest，2009；69(1)：138-44.

5Furuichi K，Kaneko S，Wada T.Chemokine/chemokine receptor-mediated inflammation regulates pathologic changes from acute kidney injury to chronic kidney disease〔J〕.Clin Exp Nephrol，2009；13(1)：9-14.

6Nakashima T，Jinnin M，Yamane K，etal.Impaired IL-17 signaling pathway contributes to the increased collagen expression in scleroderma fibroblasts〔J〕.J Immunol，2012；188(8)：3573-83.

7Danzaki K，Matsui Y，Ikesue M，etal.Interleukin-17A deficiency accelerates unstable atherosclerotic plaque formation in apolipoprotein E-deficient mice〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2012；32(2)：273-80.

8Tuttle KR，Bakris GL，Bilous RW，etal.Diabetic kidney disease：a report from an ADA Consensus Conference〔J〕.Diabetes Care，2014；37(10)：2864-83.

9Ni WJ，Tang LQ，Wei W.Research progress in signalling pathway in diabetic nephropathy〔J〕.Diabetes Metab Res Rev，2015；31(3)：221-33.

10Bohle A，Wehrmann M，Bogenschutz O，etal.The pathogenesis of chronic renal failure in diabetic nephropathy.Investigation of 488 cases of diabetic glomerulosclerosis〔J〕.Pathol Res Pract，1991；187(2-3)：251-9.

11Navarro JF，Mora C，Muros M，etal.Urinary tumour necrosis factor-alpha excretion independently correlates with clinical markers of glomerular and tubulointerstitial injury in type 2 diabetic patients〔J〕.Nephrol Dial Transplant，2006；21(12)：3428-34.

12Usui H，Shikata K，Matsuda M，etal.HMG-CoA reductase inhibitor ameliorates diabetic nephropathy by its pleiotropic effects in rats〔J〕.Nephrol Dial Transplant，2003；18(2)：265-72.

13Rivero A，Mora C，Muros M，etal.Pathogenic perspectives for the role of inflammation in diabetic nephropathy〔J〕.Clin Sci (Lond)，2009；116(6)：479-92.

14Dalla VM，Mussap M，Gallina P，etal.Acute-phase markers of inflammation and glomerular structure in patients with type 2 diabetes〔J〕.J Am Soc Nephrol，2005；16(Suppl 1)：S78-82.

15Nakashima T，Jinnin M，Yamane K，etal.Impaired IL-17 signaling pathway contributes to the increased collagen expression in scleroderma fibroblasts〔J〕.J Immunol，2012；188(8)：3573-83.

16Aggarwal S，Gurney AL.IL-17：prototype member of an emerging cytokine family〔J〕.J Leukoc Biol，2002；71(1)：1-8.

17Taleb S，Romain M，Ramkhelawon B，etal.Loss of SOCS3 expression in T cells reveals a regulatory role for interleukin-17 in atherosclerosis〔J〕.J Exp Med，2009；206(10)：2067-77.

18Danzaki K，Matsui Y，Ikesue M，etal.Interleukin-17A deficiency accelerates unstable atherosclerotic plaque formation in apolipoprotein E-deficient mice〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2012；32(2)：273-80.

19Tong Z，Liu W，Yan H，etal.Interleukin-17A deficiency ameliorates streptozotocin-induced diabetes〔J〕.Immunology，2015；146(2)：339-46.

20Sanford M，McKeage K.Secukinumab：first global approval〔J〕.Drugs，2015；75(3)：329-38.

〔2017-03-11修回〕

(編輯 李相軍)

R587.1

A

1005-9202(2017)19-4729-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.017

云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學聯合專項基礎研究基金(No.2015FB054)

1 昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院泌尿外科 2 昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院放射科

楊 敏(1971-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事急、慢性腎臟病研究。

白彝華(1981-)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事急、慢性腎臟病研究。