HPLC法同時測定牛黃寧宮片中6種成分的含量

孫艷濤，宋玉紅，趙磊，于浪天，王良（1.吉林師范大學化學學院，吉林四平16000；2.吉林師范大學環境友好材料制備與應用省部共建教育部重點實驗室，吉林四平 1010；.吉林省四平市食品藥品檢驗所，吉林四平 16099；.中國藥科大學中藥學院，南京 211198）

HPLC法同時測定牛黃寧宮片中6種成分的含量

孫艷濤1，2＊，宋玉紅1，2，趙磊3，于浪天4，王良1#（1.吉林師范大學化學學院，吉林四平136000；2.吉林師范大學環境友好材料制備與應用省部共建教育部重點實驗室，吉林四平 130103；3.吉林省四平市食品藥品檢驗所，吉林四平 136099；4.中國藥科大學中藥學院，南京 211198）

目的：建立同時測定牛黃寧宮片中6種成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為TC-C18，流動相為甲醇-0.05%磷酸（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為280 nm，柱溫為25℃，進樣量為10μL。結果：甘草苷、鹽酸小檗堿、連翹苷、黃芩苷、大黃素和大黃酚檢測質量濃度線性范圍分別為3.2～320 μg/mL（r＝0.999 9）、8.8～880 μg/mL（r＝0.999 8）、5.6～560μg/mL（r＝0.999 5）、2.0～200 μg/mL（r＝0.999 9）、4.4～440 μg/mL（r＝0.999 9）、2.0～200 μg/mL（r＝0.999 7）；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜6.0%；加樣回收率分別為96.34%～97.25%（RSD＝0.33%，n＝6）、96.12%～98.06%（RSD＝0.82%，n＝6）、96.36%～99.09%（RSD＝1.02%，n＝6）、95.84%～97.32%（RSD＝0.65%，n＝6）、95.83%～97.92%（RSD＝0.88%，n＝6）、98.60%～99.65%（RSD＝0.42%，n＝6）。結論：該方法操作簡便，精密度、穩定性、重復性好，可用于牛黃寧宮片中6種成分含量的測定。

牛黃寧宮片；高效液相色譜法；含量測定

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of 6 components in Niuhuang ninggong tablets.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on TC-C18column with mobile phase consisted of methanol-0.05%phosphate acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 280 nm，and the column temperature was 25℃.The sample size was 10μL.RESULTS：The linear ranges of glycyrrhizin，berberine hydrochloride，baicalin，baicalin，emodin and chrysophanol were 3.2-320 μg/mL（r＝0.999 9），8.8-880 μg/mL（r＝0.999 8），5.6-560 μg/mL（r＝0.999 5），2.0-200 μg/mL（r＝0.999 9），4.4-440 μg/mL（r＝0.999 9），2.0-200 μg/mL（r＝0.999 7），respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 6.0%.The recoveries were 96.34%-97.25%（RSD＝0.33%，n＝6），96.12%-98.06%（RSD＝0.82%，n＝6），96.36%-99.09%（RSD＝1.02%，n＝6），95.84%-97.32%（RSD＝0.65%，n＝6），95.83%-97.92%（RSD＝0.88%，n＝6），98.60%-99.65%（RSD＝0.42%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate，stable and reproducible，and can be used for content determination of 6 components in Niuhuang ninggong tablets.

KEYWORDSNiuhuang ninggong tablets；HPLC；Content determination

中成藥作為一個完整的制劑，強調的是各味藥材的協同作用。目前，以單一有效成分或指標成分難以真正控制中成藥質量。有些中成藥生產企業為了降低成本，利用藥檢質量標準不能完全控制所有藥材的漏洞，漏加、少加藥材。因此，必需建立一種快速、準確、全面分離、檢測中成藥中多種活性成分的方法，以便更好地監控中成藥質量和用藥安全[1-4]。

精神分裂癥是最常見和最嚴重的精神疾病之一[5]。牛黃寧宮片可用于外感熱病、高熱神昏、驚風抽搐、肝陽眩暈、耳鳴頭痛、心煩不寐及癲癇狂燥的治療，對精神分裂癥有一定的抗復發作用[6-12]。牛黃寧宮片由牛黃、蒲公英、雄黃、連翹、大黃、冰片、金銀花、甘草、黃連、黃芩、鉤藤、大黃磁石（煅）、玄參、葛根等27味中藥材經提取加工制成，該制劑收錄于《中國衛生部藥品標準中藥成方制劑》（WS3-B-2852-98）。原質量標準中僅有簡單的顯微鑒別、砷量檢測和膽酸含量檢測[13]。專利“一種控制牛黃寧宮片質量的方法”也僅對性狀鑒別、顯微及薄層色譜鑒別、三氧化二砷檢驗和黃芩含量測定進行了控制[14]。上述方法檢測指標少，有可能導致其他組分不穩定或缺乏，難以全面準確控制藥品質量。目前，有關牛黃寧宮片中多個活性成分含量的測定未見報道。本試驗采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定牛黃寧宮片中6種成分的含量，為全面控制該制劑的質量提供理論基礎。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，包括VWD檢測器（美國Agilent公司）；UV-2550型紫外分光光度計（日本Shimadzu公司）；FA1104N型萬分之一電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司）；SK5200H型超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

牛黃寧宮片（沈陽紅藥制藥有限公司，批號：Z21021460，規格：0.34 g/片）；大黃素對照品（批號：110756-200110，純度：100%）、大黃酚對照品（批號：110796-201017，純度：100%）、連翹苷對照品（批號：110821-201112，純度：96.8%）、甘草苷對照品（批號：111610-201106，純度：93.7%）、黃芩苷對照品（批號：110715-201318，純度：93.3%）、鹽酸小檗堿對照品（批號：110713-201212，純度：86.7%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：TC-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇（A）-0.05%磷酸（B），梯度洗脫（0～35 min，10%→80%A；35～55 min，80%A；55～60 min，80%→10%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：280 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10μL。在上述色譜條件下，理論板數以甘草苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、連翹苷、大黃素和大黃酚峰計均＞3 000；保留時間分別為21.73、23.05、25.96、27.74、43.20和44.28 min，各成分基線分離良好，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取待測成分對照品各適量，分別置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，稱定質量，超聲（功率：200 W，頻率：59 kHz，下同）處理30 min，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，制成甘草苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、連翹苷、大黃素、大黃酚質量濃度分別為200、800、560、320、200、440 μg/mL的單一對照品溶液。分別精密量取上述單一對照品溶液適量，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，即得。

2.2.2 供試品溶液 取樣品若干，除去糖衣，用玻璃研缽研細，精密稱取0.038 14 g，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，稱定質量，超聲處理45 min，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，靜置24 h，濾過，即得。

2.3 線性關系考察

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.1、0.5、1、2、4、5、6、7、8、9、10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Linear equations and linear ranges

2.4 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，甘草苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、連翹苷、大黃素、大黃酚峰面積的RSD分別為1.41%、2.80%、2.87%、2.11%、1.02%、1.45%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：Z21021460）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，甘草苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、連翹苷、大黃素、大黃酚峰面積的RSD分別為0.76%、1.56%、2.56%、2.09%、4.96%、5.68%（n＝5），表明供試品溶液室溫放置12 h內基本穩定。

2.6 重復性試驗

精密稱取同一批樣品（批號：Z21021460）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，甘草苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、連翹苷、大黃素、大黃酚峰面積的RSD分別為1.51%、1.46%、6.44%、2.46%、1.54%、1.98%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗

取已知含量樣品（批號：Z21021460）適量，共6份，分別加入一定質量的待測成分對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 2 Results of recovery tests（n＝6）

2.8 樣品含量測定

取樣品適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結果，樣品中甘草苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、連翹苷、大黃素、大黃酚含量平均值分別為1.161 4、0.220 3、0.467 2、0.194 0、0.162 2、1.136 0 mg/g（n＝3）。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

通過紫外分光光度計對大黃酚、大黃素、甘草苷、連翹苷、黃芩苷和鹽酸小檗堿進行測定，發現上述幾種成分在280 nm波長處均有較好的紫外吸收，故采用280 nm作為檢測波長。

3.2 流動相的選擇

預試驗中筆者分別選用甲醇-水（70∶30，V/V，等度洗脫）、甲醇-水（梯度洗脫）、甲醇-0.05%磷酸溶液（梯度洗脫）、乙腈-水（80∶20，V/V，等度洗脫）、甲醇-0.05%磷酸溶液（梯度洗脫）作流動相。結果顯示，流動相為甲醇-0.05%磷酸溶液（梯度洗脫）時，色譜峰能夠很好地分離，且峰形較好，可有效地縮短分析時間，滿足分析要求。

綜上所述，本方法操作簡便，精密度、穩定性、重復性好，可用于牛黃寧宮片中6種成分含量的測定。

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（編輯：張 靜）

Simultaneous Determination of 6 Components in Niuhuang Ninggong Tablets by HPLC

SUN Yantao1，2，SONG Yuhong1，2，ZHAO Lei3，YU Langtian4，WANG Liang1（1.College of Chemistry，Jilin Normal University，Jilin Siping 136000，China；2.Key Laboratory of Preparation and Application of Environmental Friendly Materials，Ministry of Education，Jilin Normal University，Jilin Siping 130103，China；3.Siping Institute for Food and Drug Control，Jilin Siping 136099，China；4.College of TCM，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China）

R286；R927

A

1001-0408（2017）27-3862-03

2016-10-12

2016-12-08）

＊副教授。研究方向：光譜分析和色譜分析。E-mail：1979yanzi@163.com

#通信作者：教授。研究方向：分析化學。E-mail：16421800@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.27.33