HPLC法同時(shí)測(cè)定不同配伍比例三棱-莪術(shù)藥對(duì)中P-香豆酸、阿魏酸的含量Δ

李洋，季方茹，潘洪秀，宗希明，繆月英，楊銘，丁立新（佳木斯大學(xué)藥學(xué)院/黑龍江省生物藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江佳木斯 154007）

HPLC法同時(shí)測(cè)定不同配伍比例三棱-莪術(shù)藥對(duì)中P-香豆酸、阿魏酸的含量Δ

李洋＊，季方茹，潘洪秀，宗希明，繆月英，楊銘，丁立新#（佳木斯大學(xué)藥學(xué)院/黑龍江省生物藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江佳木斯 154007）

目的：建立同時(shí)測(cè)定三棱-莪術(shù)藥對(duì)中P-香豆酸、阿魏酸含量的方法，探討不同比例藥對(duì)中二者含量的變化。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Agilent 20RBAX XDB-C18，流動(dòng)相為乙腈-0.1%冰醋酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為266 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10μL。結(jié)果：P-香豆酸、阿魏酸檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為4.218 6～21.093 μg/mL（r＝0.999 8）、1.836 0～9.180 μg/mL（r＝0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為98.72%～100.30%（RSD＝0.18%，n＝9）、99.11%～100.45%（RSD＝0.46%，n＝9）。三棱-莪術(shù)藥對(duì)4個(gè)配伍比例（1∶1、2∶1、1∶2、1∶0，m/m）中，三棱-莪術(shù)比例（m/m）為2∶1時(shí)P-香豆酸、阿魏酸含量最高。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于三棱-莪術(shù)藥對(duì)中P-香豆酸、阿魏酸含量的同時(shí)測(cè)定；該藥對(duì)中三棱-莪術(shù)比例（m/m）為2∶1時(shí)主要有效成分含量最高。

高效液相色譜法；三棱-莪術(shù)；藥對(duì)；P-香豆酸；阿魏酸；含量測(cè)定

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of P-coumaric acid and ferulic acid in the couple of Sparganium stoloni and Curcuma aeruginosa，and to investigate rational proportion of the couple.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Agilent 20RBAX XDB-C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 266 nm，and the column temperature was 30℃.The sample size was 10μL.RESULTS：The linear ranges of P-coumaric acid and ferulic acid were 4.218 6-21.093 μg/mL（r＝0.999 8），1.836 0-9.180 μg/mL（r＝0.999 9），respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 2.0%.The recoveries were 98.72%-100.30%（RSD＝0.18%，n＝9），99.11%-100.45%（RSD＝0.46%，n＝9）.Among 4 compatibility proportions of the couple of S.stoloni and C.aeruginosa（1∶1，2∶1，1∶2，1∶0，m/m），the dissolution rate of P-coumaric acid and ferulic acid were the highest when the ratio of S.stoloni-C.aeruginosa（m/m）was 2∶1.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate，stable and reproducible，and can be used for content determination of P-coumaric acid and ferulic acid in the couple of S.stoloni and C.aeruginosa.when the proportion of the couple of S.stoloni and C.aeruginosa is 2∶1 and the contents of P-coumaric and ferulic acid are the highest，the contents of main etfective components are the highest.

KEYWORDSHPLC；Sparganium stoloni-Curcuma aeruginosa；Couple；P-coumaric acid；Ferulic acid；Content determination

三棱、莪術(shù)為活血化瘀中藥配伍中最常用的藥對(duì)[1-3]。二者配伍最早出自《經(jīng)驗(yàn)良方》三棱丸，兩藥以等量配伍，氣血兼顧，活血祛瘀、行氣止痛、化積消癥之力增強(qiáng)[4-7]；現(xiàn)兩味藥材常用配伍比例（m/m）為1∶1～4∶1[8]。目前兩味藥材作為單味藥進(jìn)行化學(xué)成分研究和藥理毒理研究較多[9-10]，而不同配伍比例后的物質(zhì)基礎(chǔ)研究則相對(duì)薄弱，尤其是建立藥對(duì)的質(zhì)量控制方法方面[11-12]。2015年版《中國(guó)藥典》（一部）未見三棱含量的測(cè)定[13]，根據(jù)文獻(xiàn)資料顯示，三棱中P-香豆酸、阿魏酸為其主要活性成分[14-15]；同時(shí)，也未見不同配伍比例三棱-莪術(shù)藥對(duì)含量測(cè)定的報(bào)道。為此，本試驗(yàn)建立了采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定三棱-莪術(shù)藥對(duì)中P-香豆酸、阿魏酸的含量，通過優(yōu)化色譜條件和樣品處理的方法，快速、準(zhǔn)確地測(cè)定不同配伍比例三棱-莪術(shù)藥對(duì)中P-香豆酸、阿魏酸的含量變化，為三棱-莪術(shù)藥對(duì)質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，包括G1311A四元泵、G1379A真空再線脫氣機(jī)、G1315DAD檢測(cè)器、G1316A柱溫箱（美國(guó)Agilent公司）；FW177型中藥粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試劑

P-香豆酸對(duì)照品（批號(hào)：50198436，純度：＞99.8%）、阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)：07739910，純度：＞99.8%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

莪術(shù)、三棱藥材購(gòu)于佳木斯市金天藥店，經(jīng)佳木斯大學(xué)藥學(xué)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)中心宗希明高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性考察

色譜柱：Agilent 20RBAX XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%冰醋酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，5%A；5～15 min，20%A；15～35 min，100%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：266 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以P-香豆酸、阿魏酸峰計(jì)均＞3 000；對(duì)稱因子均在0.95～1.05之間；各成分基線分離良好，分離度均＞1.5，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取待測(cè)成分適量，置于同一5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成P-香豆酸、阿魏酸質(zhì)量濃度分別為0.703 1、0.306 0 g/L的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 按三棱-莪術(shù)比例（m/m）為1∶1、2∶1、1∶2、1∶0分別取莪術(shù)、三棱共200 g，置于2 000 mL圓底燒瓶中，加8倍量60%乙醇溶液，回流提取2次，每次2 h，合并提取液，濾過，濃縮，冷凍，干燥得提取物粉末；取粉末適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL，分別置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，制成系列對(duì)照品溶液。精密量取上述系列對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得P-香豆酸、阿魏酸回歸方程分別為y＝1 764.2x+231.65（r＝0.999 8）、y＝416.43x+86.53（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，P-香豆酸、阿魏酸檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為4.218 6～21.093、1.836 0～9.180 μg/mL。

2.4 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，P-香豆酸、阿魏酸峰面積的RSD均為1.1%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下混合供試品溶液[三棱-莪術(shù)（2∶1，m/m）]適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、16、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，P-香豆酸、阿魏酸峰面積的RSD分別為1.0%、1.3%（n＝6），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品[三棱-莪術(shù)（2∶1，m/m）]適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，P-香豆酸、阿魏酸峰面積的RSD分別為0.21%、0.26%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量樣品[三棱-莪術(shù)（2∶1，m/m）]適量，共9份，分別加入低、中、高質(zhì)量的待測(cè)成分對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.8 樣品含量測(cè)定

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

取藥材樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝6，mg/g）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝6，mg/g）

由表2可知，三棱中的主要成分并未隨三棱藥材量的增加而增加；當(dāng)三棱-莪術(shù)比例（m/m）為2∶1時(shí)，P-香豆酸和阿魏酸的含量最高。

3 討論

預(yù)試驗(yàn)中，筆者比較了超聲和回流提取方法制備供試品溶液的差別，結(jié)果顯示回流提取結(jié)果優(yōu)于超聲提取結(jié)果，故采用回流提取方法。筆者分別采用了甲醇-水、乙腈-水作為流動(dòng)相，結(jié)果顯示甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)出峰較慢且分離度不理想，乙腈-水作為流動(dòng)相雖然能全部分離，但是組分峰有拖尾現(xiàn)象，故分別在水相中加入甲酸、磷酸、冰醋酸作為改性劑，通過比較發(fā)現(xiàn)加入冰醋酸后峰形較好；并進(jìn)一步考查冰醋酸的用量，結(jié)果顯示乙腈-0.1%冰醋酸溶液作為流動(dòng)相，組分完全分離，且峰形好，出峰快。由于中藥藥對(duì)成分復(fù)雜，因此試驗(yàn)采用梯度洗脫。

本研究藥對(duì)不同配伍比例中的含量變化結(jié)果表明，三棱中主要成分并未隨三棱藥材量的增加而增加，同時(shí)與傳統(tǒng)方劑三棱丸中三棱-莪術(shù)比例（m/m）為1∶1比較，三棱-莪術(shù)比例（m/m）為2∶1時(shí)，P-香豆酸和阿魏酸的綜合含量最高。但三棱、莪術(shù)不同配伍比例時(shí)其他成分含量的考察及藥效學(xué)研究有待進(jìn)一步探討。

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Simultaneous Determination of P-coumaric Acid and Ferulic Acid in Different Compatibility Proportions of the Couple of Sparganium stoloni and Curcuma aeruginosa by HPLC

LI Yang，JI Fangru，PAN Hongxiu，ZONG Ximing，MIAO Yueying，YANG Ming，DING Lixin（Pharmaceutical School of Jiamusi University/Heilongjiang Province Key Lab of Biological Medicine Preparation，Heilongjiang Jiamusi 154007，China）

R927

A

1001-0408（2017）27-3859-03

2016-10-05

2016-12-01）

（編輯：張 靜）

佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)研究類項(xiàng)目（No.JMSUJCMS2016-035）

＊碩士研究生。研究方向：中藥分析。電話：0454-8610758

#通信作者：教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：天然產(chǎn)物分離、分析。E-mail：DLX200475@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.27.32