微波消解-ICP-MS法測(cè)定青海和西藏產(chǎn)區(qū)冬蟲夏草中的35種元素

張敏敏，趙恒強(qiáng)，趙志國，劉偉，劉倩，梁琰，耿巖玲，黃璐琦，王曉*

(1. 山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省科學(xué)院中藥過程控制研究中心，山東省分析測(cè)試中心，山東 濟(jì)南 250014；2. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，道地藥材國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，中國中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700)

【中藥與天然活性產(chǎn)物】

微波消解-ICP-MS法測(cè)定青海和西藏產(chǎn)區(qū)冬蟲夏草中的35種元素

張敏敏1，趙恒強(qiáng)1，趙志國1，劉偉1，劉倩1，梁琰1，耿巖玲1，黃璐琦2，王曉1*

(1. 山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省科學(xué)院中藥過程控制研究中心，山東省分析測(cè)試中心，山東 濟(jì)南 250014；2. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，道地藥材國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，中國中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700)

為了測(cè)定青海和西藏產(chǎn)區(qū)的17批冬蟲夏草中的35種元素(其中16種為稀土元素)的含量，并進(jìn)行初步產(chǎn)地鑒別分析，運(yùn)用微波消解-ICP-MS法測(cè)定了3批玉樹、4批那曲和10批果洛產(chǎn)區(qū)的蟲草樣本，并對(duì)3個(gè)產(chǎn)區(qū)的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明，不同產(chǎn)區(qū)的蟲草藥材各種元素含量差別較大，本文對(duì)其中4種有害元素Cd, Pb, As, Cu推薦了限量標(biāo)準(zhǔn)；聚類分析結(jié)果表明，玉樹和果洛產(chǎn)區(qū)聚類較近、差異性較小；那曲產(chǎn)區(qū)聚類較遠(yuǎn)，相對(duì)差異性較大。該方法快捷、準(zhǔn)確、可行性強(qiáng)，為不同產(chǎn)地冬蟲夏草藥材的質(zhì)控和用藥安全指導(dǎo)提供了理論依據(jù)。

ICP-MS; 冬蟲夏草；微量元素；稀土元素

Abstract∶To determine the contents of 35 elements (including 16 rare earth elements) in 17 batches of Chinese caterpillar fungus from Qinghai and Tibet and make preliminary identification analysis of their habitats, a total of 35 elements in Chinese caterpillar fungus samples were determined by microwave digestion-ICP-MS, including 3 batches from Yushu, 4 batches from Naqu and 10 batches from Guoluo. Furthermore, cluster analysis was carried out on the measurement results of 3 producing areas. Results showed that the contents of 35 elements in 17 kinds of Chinese caterpillar fungus samples from different origins have obvious differences. And the limits of the 4 kinds of harmful elements (Cd, Pb, As and Cu) were recommended. The results of cluster analysis showed that the samples from Yushu and Guoluo were close, and the difference was small, while the sample from Naqu was far away, and its relative difference was larger. This method is quick, accurate and feasible, which provides a theoretical basis for quality control and medication guidance of Chinese caterpillar fungus from different habitats.

Key words∶ICP-MS;Chinese caterpillar fungus; trace elements; rare earth elements

冬蟲夏草又稱蟲草，為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌Cordycepssinensis(Berk. ) Sacc. 寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復(fù)合體[1]。冬蟲夏草作為我國傳統(tǒng)珍貴滋補(bǔ)類中藥，具有調(diào)節(jié)免疫，抗腫瘤，抗疲勞，調(diào)節(jié)心臟、肝臟、呼吸系統(tǒng)等多種功效[2]。我國冬蟲夏草主要產(chǎn)于西藏和青海的高山地區(qū)[3]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，冬蟲夏草含有多糖、核苷、氨基酸、糖醇、甾醇、脂肪酸等多種化學(xué)成分[4-5]。另外，蟲草中還含有Na、Mg、K、Go、Ce、Nd、Er等多種元素[6-7]。這些元素的含量存在產(chǎn)地差異，對(duì)冬蟲夏草的品質(zhì)具有很大影響。因此，為保證用藥安全、有效，對(duì)蟲草中元素含量的測(cè)定具有重要意義。

在中藥微量元素研究中，離子光譜法、分光光度法、離子選擇電極法、微分電位溶出法、催化示波極譜法、中子活化分析法、能量色散射線分析法、冷蒸氣原子吸收光譜法、原子熒光法、分子熒光法以及加壓消解-原子吸收光譜法等多種方法被不斷改進(jìn)和應(yīng)用[8]。其中，電感耦合等離子體質(zhì)譜法(inductively coupled plasma mass spectrometry， ICP-MS)以其高靈敏度、高精密度、高穩(wěn)定性和低檢出限等優(yōu)點(diǎn)成為中藥痕量元素分析的一個(gè)強(qiáng)有力的工具[9]，另外，ICP-MS法可以同時(shí)測(cè)定多種元素的優(yōu)勢(shì)是原子吸收光譜法不能比擬的[10]。原子吸收光譜法分析速度慢，線性范圍窄，可分析的元素也較ICP-MS和電感耦合等離子原子發(fā)射光譜少，原子熒光法則僅限于可氫化反應(yīng)的幾種元素如As、Se等。因此，本研究利用微波消解法作為樣品預(yù)處理方法，結(jié)合ICP-MS法對(duì)冬蟲夏草樣本進(jìn)行測(cè)定，并結(jié)合R型因子聚類分析方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，對(duì)冬蟲夏草藥材的質(zhì)控和用藥指導(dǎo)具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器、試劑與材料

Speed wave MW-3微波消解系統(tǒng)(德國Berghof)；7500a型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國Agilent)；萬分之一電子分析天平(德國Sartourius)；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)(18.2 MΩ，美國Milipore)。

濃硝酸(優(yōu)級(jí)純，德國Merck)、過氧化氫(優(yōu)級(jí)純，德國Merck)；液氬(純度99.999%)；多元素混標(biāo)Part#5183-4688及內(nèi)標(biāo)Part#5183-4680溶液(美國Agilent)，其中 Fe、K、Ca、Na、Mg、Ag、Al、As、Ba、Be、Cd、Co、Cr、Cu、Mn、Mo、Ni、Pb、Sb、Se、Tl、V、Zn、Th、U的含量為1.0 mg/L；基體為體積分?jǐn)?shù)10%硝酸。

稀土多元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(G8500-6955，美國 Agilent) ， Sc、Y、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu含量均為10 mg/mL。

樣品消解前均經(jīng)過粉碎，本實(shí)驗(yàn)采用國家一級(jí)茶葉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW 07605 (地礦部物化探研究所)進(jìn)行分析方法的質(zhì)量控制。冬蟲夏草藥材購于濟(jì)南市各大藥店和GAP種植基地，樣品信息見表1。

表1 樣品信息

1.2樣品預(yù)處理

精密稱定冬蟲夏草樣品粉末0.3 g，置于消解罐中，加入5 mL高純硝酸，虛掩罐蓋，放置過夜進(jìn)行預(yù)消解，以排出硝酸與樣品反應(yīng)所生成的氣體。然后將消解罐旋緊，放入微波爐中，按照LEAF消解程序設(shè)定的步驟進(jìn)行升溫消解，消解結(jié)束，待消解罐冷卻后，擰開加入1 mL 過氧化氫，待樣品變?yōu)闊o色透明溶液后，用超純水定容至30 g，進(jìn)行分析。

具體消解程序?yàn)椋何⒉ㄏ鈽悠凡捎肧peed wave MW-3微波消解系統(tǒng)中自帶的LEAF消解程序，按照100 ℃-180 ℃-200 ℃-210 ℃的步驟進(jìn)行升溫，每次升溫過程時(shí)間為2 min，每個(gè)溫度下保持10 min，整個(gè)消解過程歷時(shí)48 min。

1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

采用Agilent稀土多元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Part#G8500-6955，以5%的硝酸稀釋配制Sc、Y、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu 16種稀土元素濃度分別為0.1 μg/L、0.5 μg/L、1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L和10 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

以5%的硝酸作為空白，分別利用Agilent多元素混標(biāo)Part#5183-4688配制Na、Mg、K、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Mo、Cd、Pb、Th、U等19種元素濃度分別為1 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L和100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。對(duì)以上標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，作出標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。測(cè)定過程中以187 Re、115 In、103 Rh為內(nèi)標(biāo)，校正儀器可能的漂移。

1.4樣品測(cè)定

將預(yù)處理的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品溶液依照表2中ICP-MS儀器工作參數(shù)進(jìn)樣分析。

表2 Agilent 7500a ICP-MS儀器工作參數(shù)

1.5數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用 DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，采用單因素方差分析(ANOVA)對(duì)所有樣品的所有元素進(jìn)行了差異性分析。采用R型因子聚類分析對(duì)3產(chǎn)地樣本均值進(jìn)行分析，評(píng)估不同產(chǎn)區(qū)冬蟲夏草藥材有無顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1方法學(xué)考察

2.1.1 線性方程

按1.4項(xiàng)下條件下對(duì)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，得出各元素線性關(guān)系方程，結(jié)果見表3。

表3 35種元素線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.1.2 精密度與加標(biāo)回收率

按照1.4條件將同一個(gè)樣品平行進(jìn)樣分析6次，記錄結(jié)果并計(jì)算各元素含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其RSD值均小于3.0%，即該方法精密度良好。同時(shí)，對(duì)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定。結(jié)果表明，各元素回收率分別為Na (99.52%)、Mg (98.73%)、K (103.02%)、Ca (101.55%)、V (101.78%)、Cr (97.21%)、Mn (100.19%)、Fe (102.93%)、Co (98.38%)、Ni (97.82%)、Cu (102.69%)、Zn (103.27%)、As (99.46%)、Se (07.84%)、Mo (101.92%)、Cd (103.07%)、Pb (100.48%)、Th (98.05%)、U (96.38%)、Sc (98.26%)、Y (97.33%)、La (103.52%)、Ce (98.38%)、Pr (102.48%)、Nd (96.82%)、Sm (102.31%)、Eu (101.91%)、Gd (97.27%)、Tb (103.51%)、Dy (98.58%)、Ho (99.18%)、Er (97.37%)、Tm (103.55%)、Yb (100.63%)、Lu (102.04%)，均在96%～104%之間，符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.2不同產(chǎn)地蟲草多元素含量測(cè)定結(jié)果

對(duì)3個(gè)產(chǎn)區(qū)的17批冬蟲夏草藥材中的35種微量元素進(jìn)行含量測(cè)定，分別求出不同產(chǎn)區(qū)的蟲草藥材中這35種元素含量的平均含量和17批蟲草中該類元素的總平均值，結(jié)果見表4。其中，Na、Mg、K、Ca、Fe 5種元素的含量較高。Mg和 Ca作為與人類關(guān)系最為密切的常量元素，對(duì)人體的健康起著重要的作用，Mg調(diào)節(jié)胰島素的敏感性和糖代謝的穩(wěn)定性，Ca則會(huì)影響人體骨骼密度等。另外，Na 、K元素對(duì)于調(diào)節(jié)血壓起著重要作用，F(xiàn)e在人體內(nèi)的含量遠(yuǎn)低于前4種，但其對(duì)人體造血功能具有很大的影響。在表4中可以看出，青海果洛地區(qū)的蟲草所含Mg、K、Ca的量高于其他兩個(gè)產(chǎn)區(qū)，而青海玉樹產(chǎn)區(qū)的蟲草中Na、Fe的含量較高。另外，西藏那曲產(chǎn)區(qū)的蟲草中Ca、Fe含量遠(yuǎn)低于3個(gè)產(chǎn)區(qū)這兩種元素含量的總平均值，這可能與當(dāng)?shù)氐刭|(zhì)環(huán)境有關(guān)。

表4 3個(gè)產(chǎn)地冬蟲夏草藥材中35種元素含量的平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

注：*表示單位為 mg/g, 其余均為 μg/g。

Zn、Cu、Cr、Mn、Co、Se、V、Ni和Mo作為人體必需微量元素，均在各批次蟲草中檢出。其中，Mn、Cu、Zn含量較高，僅次于Na、Mg、K、Ca、Fe 5種元素。而且，青海果洛產(chǎn)區(qū)的蟲草中這3種元素含量高于另外兩個(gè)產(chǎn)區(qū)。對(duì)人體明顯有害的元素如Cd、Pb、As等，也在蟲草樣本中均有檢出。Cd在3個(gè)產(chǎn)區(qū)樣本中的含量較為均勻，Pb、As在玉樹和果洛兩產(chǎn)區(qū)樣本中的含量均遠(yuǎn)高于那曲產(chǎn)區(qū)。在3個(gè)產(chǎn)區(qū)樣本中，Pb和Cd元素含量均未超過藥典標(biāo)準(zhǔn)[11](Pb不得過10 mg/kg；Cd不得過1 mg/kg)，那曲產(chǎn)區(qū)As元素含量未超過藥典標(biāo)準(zhǔn)(As不得過5 mg/kg)，但玉樹產(chǎn)區(qū)(5.760±3.413 μg/g)、果洛產(chǎn)區(qū)( 7.437±2.750 μg/g)均已超過藥典標(biāo)準(zhǔn)。

根據(jù)WHO規(guī)定的各元素人體每周耐受攝入量(PTWI)值(Cd: 0.007 mg/kg; Pb: 0.025 mg/kg; As: 0.015 mg/kg; Cu: 0.5 mg/kg)，結(jié)合《中國藥典》中規(guī)定冬蟲夏草的用量 3～9 g，最大限量計(jì)算采用其均值 6 g 為日攝入量。按照《中國藥典》第四部9302項(xiàng)中藥有害殘留物限量制定指導(dǎo)原則推薦計(jì)算公式為：

L=AW/10M，

其中，L為最大限量理論值，mg/kg；A為每日允許攝入量，mg/kg；W為人體平均體重，kg，一般按60 kg計(jì)；M為中藥材(飲片)每日人均可服用的最大劑量，kg。按照公式計(jì)算，可得出這4種有害元素限值標(biāo)準(zhǔn)分別為Cd: 1.00 mg/kg; Pb: 3.57 mg/kg; As: 2.14 mg/kg; Cu: 500 mg/kg。對(duì)比表4 可知，3個(gè)產(chǎn)區(qū)冬蟲夏草中Cd、 Pb、 As、 Cu 4種有害元素的含量均未超標(biāo)。考慮到《中國藥典》一部中還沒有該4種有害元素的限量標(biāo)準(zhǔn)，本研究綜合考慮《中國藥典》第四部9302項(xiàng)——中藥有害殘留物限量制定指導(dǎo)原則，以及西藏、青海不同產(chǎn)區(qū)多批次蟲草樣品含量測(cè)定結(jié)果，給出了冬蟲夏草中這4種有害元素的建議質(zhì)控范圍為：w(Cd)<1.00 mg/kg;w(Pb)<3.57mg/kg;w(As)<2.14 mg/kg;w(Cu)<500 mg/kg。

另外，由RSD值可以看出， Na、Mg、K、Mn、Zn、Cu、As、Cd這8種元素在3個(gè)產(chǎn)區(qū)蟲草中的含量差別較小，分布較為均勻。元素Tm的含量差異性最大，其RSD值高達(dá)0.806。綜合來看，稀土元素的差異性大于其余元素的差異性。

2.3 R型因子聚類分析

R型因子聚類分析是一種快捷、簡便的聚類分析方法，目前已被用于中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)[12]。為了簡潔、明確地判別蟲草藥材中微量元素和其中的稀土元素含量的產(chǎn)地差異，我們將3個(gè)產(chǎn)區(qū)的蟲草樣品中這些元素含量的數(shù)據(jù)進(jìn)行了R型因子聚類分析，結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，那曲產(chǎn)區(qū)的均值Nave與另外兩組玉樹和果洛的均值Yave和Gave的聚類較遠(yuǎn)，說明那曲產(chǎn)區(qū)的蟲草樣本與另外兩個(gè)產(chǎn)區(qū)果洛和玉樹的蟲草樣本差異性較大。果洛與玉樹同屬于青海省且相鄰，因此兩地樣本聚類較近，差異性較小。

Yave：玉樹產(chǎn)區(qū)均值；Gave：果洛產(chǎn)區(qū)均值；Nave：那曲產(chǎn)區(qū)均值。圖1 3個(gè)產(chǎn)地各元素含量均值R型因子聚類分析Fig.1 R-type cluster analysis of element contents in 3 areas

3 結(jié)論

本文利用微波消解-ICP-MS法對(duì)西藏、青海產(chǎn)區(qū)的17批冬蟲夏草樣本中35種微量元素(含16種稀土元素)的含量進(jìn)行測(cè)定，并用R型因子聚類分析對(duì)樣本進(jìn)行分析。該方法操作簡便、靈敏度高、能耗較小、污染少、效率較高，適用于大量樣本元素分析和產(chǎn)地鑒別。該研究為冬蟲夏草藥材的質(zhì)控和用藥指導(dǎo)提供了科學(xué)依據(jù)。然而，就目前的研究狀態(tài)看，ICP-MS法運(yùn)行成本高是其主要的缺陷。未來可以針對(duì)其運(yùn)行成本問題加以優(yōu)化，來實(shí)現(xiàn)低成本運(yùn)行。

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Determination of35elements in Chinese caterpillar fungus from Qinghai and Tibet by microwave digestion-ICP-MS

ZHANG Min-min1,ZHAO Heng-qiang1,ZHAO Zhi-guo1,LIU Wei1, LIU Qian1,LIANG Yan1,GENG Yan-ling1,HUANG Lu-qi2,WANG Xiao1*

(1.Shandong Provincial Key Laboratory Breeding Base of TCM Quality Control Technology, Process Control Research Center of Traditional Chinese Medicine of Shandong Academy of Sciences, Shandong Analysis and Test Center, Jinan 250014, China; 2.National Resource Chinese Center for Materia Medica, Key Laboratory of Road to the Cultivation of Chinese Medicine ，China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700,China)

R284.1

A

1002-4026(2017)05-0014-07

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.05.003

2017-05-10

中央本級(jí)重大增減支項(xiàng)目(2060302)；國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(81130070)

張敏敏(1990—)，女，碩士研究生， 研究方向?yàn)橹兴幏治雠c質(zhì)量控制。E-mail:zhangminminff@163.com

*通信作者，王曉(1971—)，男，研究員，博士，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制研究。Tel: 0531-82605319,E-mail: wxjn1998@126.com