提高有絲分裂實(shí)驗(yàn)效果的嘗試

楊遠(yuǎn)媛 趙京秋

（1北京市第三十五中學(xué) 北京 100035 2北京市西城區(qū)教育研修學(xué)院 北京 100000）

“植物細(xì)胞有絲分裂觀察實(shí)驗(yàn)”為高中生物學(xué)必修1第6章第1節(jié) “細(xì)胞增殖”部分的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，是學(xué)生在學(xué)習(xí)了細(xì)胞生命系統(tǒng)的物質(zhì)組成、結(jié)構(gòu)和功能之后，認(rèn)識(shí)細(xì)胞的產(chǎn)生、發(fā)展和消亡的過(guò)程。其中細(xì)胞的有絲分裂是學(xué)生后續(xù)學(xué)習(xí)減數(shù)分裂和遺傳規(guī)律的基礎(chǔ)，也是學(xué)習(xí)DNA復(fù)制及遺傳信息傳遞的重要基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖亲寣W(xué)生學(xué)會(huì)運(yùn)用根尖壓片技術(shù)，制作臨時(shí)裝片，學(xué)會(huì)辨認(rèn)洋蔥根尖細(xì)胞分裂各時(shí)期的染色體特征。實(shí)驗(yàn)涉及材料的準(zhǔn)備和培養(yǎng)、裝片的制作、顯微鏡的使用、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理等多方面的技能訓(xùn)練［1］。做好這一實(shí)驗(yàn)有助于促進(jìn)學(xué)生理解實(shí)驗(yàn)各個(gè)步驟的意義，掌握有絲分裂各個(gè)時(shí)期的特征，提升學(xué)生對(duì)有絲分裂的理解和對(duì)生物學(xué)科的興趣，達(dá)到培養(yǎng)學(xué)生生物學(xué)素養(yǎng)的目的。

本實(shí)驗(yàn)傳統(tǒng)方法包括常溫水培、取材、解離、漂洗、染色、壓片等步驟［2－3］。 但在 實(shí)際教學(xué)實(shí)踐中，筆者發(fā)現(xiàn)學(xué)生實(shí)驗(yàn)的成功率較低，分析其原因主要包括2個(gè)方面：在常規(guī)培養(yǎng)條件下植物洋蔥根尖最高有絲分裂指數(shù)為4.22%［4］，有絲分裂指數(shù)較低，導(dǎo)致學(xué)生難以觀察到各個(gè)時(shí)期的細(xì)胞；同時(shí)實(shí)驗(yàn)操作步驟多，每一步操作都有較多注意事項(xiàng)，各個(gè)環(huán)節(jié)都將直接影響實(shí)驗(yàn)的成功與否。因此本研究通過(guò)應(yīng)用同步化技術(shù)從根本上提高植物細(xì)胞有絲分裂指數(shù)，同時(shí)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)步驟，改善整個(gè)實(shí)驗(yàn)的效果，提高實(shí)驗(yàn)的成功率。

1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及器材

1）實(shí)驗(yàn)材料：洋蔥根尖。

2）實(shí)驗(yàn)試劑：1.25 mmol羥基脲溶液、卡諾氏固定液（乙醇∶冰醋酸=3∶1）、酒精（95%）、解離液、清水、0.01 g/mL龍膽紫溶液。

3）實(shí)驗(yàn)儀器：顯微鏡，載玻片，蓋玻片，鑷子，剪刀，滴管，吸水紙。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料的水培 傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)為常溫水培1周，筆者改進(jìn)為常溫+低溫水培的方法，具體的做法為將洋蔥在常溫條件下水培1周，然后再放入4℃冰箱中培養(yǎng)1個(gè)月。如此處理可讓洋蔥長(zhǎng)出許多根，且每條根都特別粗壯，避免根在長(zhǎng)期常溫培養(yǎng)條件下變細(xì)的缺點(diǎn)，一個(gè)洋蔥即可滿足40人左右班級(jí)的需要，極大減少了實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備工作。

圖1 洋蔥根對(duì)照組常溫水培和實(shí)驗(yàn)組常溫+低溫水培的對(duì)比

1.2.2 根的同步化處理 利用化學(xué)試劑羥基脲進(jìn)行同步化處理，可成倍提高根尖有絲分裂指數(shù)，具體操作如下：將0.095 g的羥基脲溶于1 L清水中制成1.25 mmol的羥基脲水溶液，將洋蔥根置于該水溶液中培養(yǎng)28 h后，用清水清洗根5次，每次3 min，以此去除阻斷劑，最后將根放入清水中恢復(fù)培養(yǎng)4～9 h。

1.2.3 固定 將有絲分裂指數(shù)處于較高時(shí)期的根尖剪下，用吸水紙吸干水分，將其放入卡諾氏固定液（乙醇∶冰醋酸=3∶1）中固定4 h以上。固定完畢后將根尖取出，再用吸水紙吸干液體。最后將根尖放入酒精中，在4℃冰箱中保存待用，注意保存時(shí)間不超過(guò)2個(gè)月。如果洋蔥根尖細(xì)胞同步化后的恢復(fù)期恰好是實(shí)驗(yàn)課上課時(shí)間，固定這一步也可省略。

以上實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作由教師完成，準(zhǔn)備時(shí)間約為2 d，該操作可節(jié)省課堂制片時(shí)間，顯著提高實(shí)驗(yàn)的成功率。

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 解離 與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)解離10 min相比，由于課前教師已完成了固定，此時(shí)將根尖取出只需用解離液處理5 min。注意要掌握好時(shí)間，如果時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則易使分生區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)脫節(jié)，不利于操作；過(guò)時(shí)間短則解離不足，壓片時(shí)細(xì)胞不易分散。

2.2 漂洗 為了減少傳統(tǒng)步驟中頻繁更換燒杯和試劑等，本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)為在一片載玻片上完成所有實(shí)驗(yàn)的方法。具體操作為：滴加完解離液后，用吸水紙吸干液體，再滴加清水3次漂洗，每次1 min。這種方法操作簡(jiǎn)單方便，節(jié)省試劑，同時(shí)也減少解離后材料的移動(dòng)和丟失。

2.3 染色 傳統(tǒng)方法使用龍膽紫染色液對(duì)洋蔥根尖細(xì)胞染色10 min，但染色效果不理想，很容易使細(xì)胞內(nèi)的其他物質(zhì)也著色。注意本實(shí)驗(yàn)為了改善染色效果，改為用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的龍膽紫溶液染色5 min后，再多加1個(gè)步驟：滴加解離液分色，分色時(shí)間為1 min。分色的原理是用解離液脫去細(xì)胞核中結(jié)合過(guò)多的染料和細(xì)胞漿中吸附的染料，以此去掉細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)的著色，使細(xì)胞核和染色體著色更清晰可見(jiàn)。

2.4 壓片 吸取多余染液和分色液，滴加1滴清水，小心蓋上蓋玻片，注意防止產(chǎn)生氣泡。然后再覆蓋吸水紙，用左手固定蓋玻片，以免移位，右手拇指輕壓蓋玻片，使細(xì)胞分散，用吸水紙吸干多余的液體，即可觀察。

2.4 改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)步驟與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)的區(qū)別 與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)比較，改進(jìn)實(shí)驗(yàn)做了如下系統(tǒng)調(diào)整：傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)為常溫水培，改進(jìn)為常溫+低溫水培的方法，傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)直接取材改進(jìn)為同步化、固定后取材，同時(shí)還縮短了解離時(shí)間，簡(jiǎn)化漂洗用具，為了改善染色效果，在染色后多加1個(gè)分色步驟。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

植物細(xì)胞同步化技術(shù)是以藥物或低溫處理打亂細(xì)胞的分裂周期，使多數(shù)細(xì)胞同時(shí)停留在分裂周期的某一階段［5］。本研究為了提高洋蔥根尖細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)，利用化學(xué)試劑HU（Hydroxyurea）阻斷法［6，7］誘導(dǎo)了多數(shù)洋蔥根尖分生區(qū)細(xì)胞同時(shí)停留在S期，通過(guò)清水洗脫去除HU阻斷，使多數(shù)細(xì)胞同步化進(jìn)入有絲分裂的下一個(gè)時(shí)期，以此達(dá)到提高有絲分裂指數(shù)的目的。通過(guò)顯微觀察統(tǒng)計(jì)多個(gè)視野中1 000以上洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)發(fā)現(xiàn)：1.25 mmol的羥基脲同步化處理洋蔥根尖28 h后，恢復(fù)培養(yǎng)4 h根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)達(dá)12%，其中前期細(xì)胞較多，恢復(fù)培養(yǎng)9 h有絲分裂指數(shù)達(dá)到11%。其中中后期細(xì)胞較多（表1、表2）。對(duì)比觀察傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)和改進(jìn)實(shí)驗(yàn)后的前期、中期、后期、末期的細(xì)胞（圖2～圖 11），筆者發(fā)現(xiàn)通過(guò)同步化處理洋蔥根尖細(xì)胞各時(shí)期分裂指數(shù)提高了3倍以上，從根本上解決了洋蔥根尖細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)較低、實(shí)驗(yàn)成功率較低的難題。同時(shí)改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)步驟當(dāng)中，水培、同步化、固定由實(shí)驗(yàn)教師完成。解離、漂洗、染色、分色、壓片由學(xué)生在課堂上完成，制片時(shí)間約為15 min。按照改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)步驟操作使得所需實(shí)驗(yàn)材料減少，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作量減小，洋蔥根尖細(xì)胞絲分裂指數(shù)提高，細(xì)胞染色體著色清晰便于觀察，有絲分裂制片步驟簡(jiǎn)化，學(xué)生操作簡(jiǎn)單方便，因此實(shí)驗(yàn)成功率顯著提高。

表1 1.25 mmol羥基脲處理28 h恢復(fù)培養(yǎng)5 h后有絲分裂各時(shí)期統(tǒng)計(jì)

表2 1.25 mmol羥基脲處理28 h恢復(fù)培養(yǎng)9 h后有絲分裂各時(shí)期統(tǒng)計(jì)

圖2 傳統(tǒng)方法實(shí)驗(yàn)后洋蔥根尖間期細(xì)胞（400×）

圖3 改進(jìn)方法實(shí)驗(yàn)后洋蔥根尖間期細(xì)胞（400×）

圖4 傳統(tǒng)方法實(shí)驗(yàn)后洋蔥根尖前期細(xì)胞（400×）

圖6 傳統(tǒng)方法實(shí)驗(yàn)后洋蔥根尖中期細(xì)胞（400×）

圖7 改進(jìn)方法實(shí)驗(yàn)后洋蔥根尖中期細(xì)胞（400×）

圖8 傳統(tǒng)方法實(shí)驗(yàn)后洋蔥根尖后期細(xì)胞（400×）

圖9 改進(jìn)方法實(shí)驗(yàn)后洋蔥根尖后期細(xì)胞（400×）

圖10 傳統(tǒng)方法實(shí)驗(yàn)后洋蔥根尖末期細(xì)胞（400×）

圖11 改進(jìn)方法實(shí)驗(yàn)后洋蔥根尖末期細(xì)胞（400×）

4 本實(shí)驗(yàn)的教學(xué)安排

本實(shí)驗(yàn)安排在學(xué)生已經(jīng)學(xué)習(xí)了 “細(xì)胞增殖”有關(guān)內(nèi)容理論知識(shí)的基礎(chǔ)上，學(xué)生對(duì)于細(xì)胞的分裂過(guò)程及各個(gè)分裂時(shí)期的染色體形態(tài)已有系統(tǒng)了解。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)教學(xué)能讓學(xué)生復(fù)習(xí)、鞏固相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作技能，深化對(duì)于有絲分裂過(guò)程的理解和認(rèn)識(shí)。但由于常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下植物根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)較低、實(shí)驗(yàn)的操作繁瑣等原因使學(xué)生實(shí)驗(yàn)的成功率較低，傳統(tǒng)教學(xué)按照驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的方法教學(xué)難以獲得較好效果。因此筆者嘗試進(jìn)行小組合作式探究實(shí)驗(yàn)教學(xué)，具體的教學(xué)過(guò)程為：在學(xué)生按照傳統(tǒng)書(shū)本實(shí)驗(yàn)操作后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的問(wèn)題，分小組分析實(shí)驗(yàn)失敗的原因，提出改進(jìn)實(shí)驗(yàn)步驟這一探究性課題。通過(guò)課題引導(dǎo)學(xué)生分小組探究改進(jìn)實(shí)驗(yàn)步驟，小組展示探究成果。最后教師小結(jié)并加入同步化技術(shù)系統(tǒng)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方案，指導(dǎo)學(xué)生按照改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)步驟當(dāng)堂操作，對(duì)比效果。小組合作式探究實(shí)驗(yàn)教學(xué)不僅能指導(dǎo)學(xué)生分析實(shí)驗(yàn)中每一步驟的作用、原理及技巧，深刻理解實(shí)驗(yàn)步驟的科學(xué)性和嚴(yán)密性，從中學(xué)習(xí)研究事物、解決問(wèn)題的方法，同時(shí)也能讓學(xué)生在一節(jié)課內(nèi)觀察到有絲分裂各個(gè)時(shí)期的細(xì)胞，并嘗試對(duì)其進(jìn)行排序，加深學(xué)生對(duì)有絲分裂整個(gè)過(guò)程及其各個(gè)時(shí)期特點(diǎn)的理解。小組合作式探究實(shí)驗(yàn)?zāi)軐⒗碚撝R(shí)的學(xué)習(xí)延伸到科研實(shí)踐，在潛移默化中培養(yǎng)了學(xué)生的科學(xué)精神和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度，讓學(xué)生體會(huì)到學(xué)以致用的快樂(lè)。