無性繁殖植株的生理年齡
——由端粒長度引發的思考

王欽美，張志宏，崔建國

(1.沈陽農業大學園藝學院，遼寧 沈陽 110866； 2.沈陽農業大學林學院，遼寧 沈陽 110866)

無性繁殖植株的生理年齡
——由端粒長度引發的思考

王欽美1,2，張志宏1*，崔建國2

(1.沈陽農業大學園藝學院，遼寧 沈陽 110866； 2.沈陽農業大學林學院，遼寧 沈陽 110866)

植物細胞中端粒長度隨年齡的變化遠比動物復雜，可分為不變組、延長組、縮短組和循環變化組。盡管如此，端粒長度亦可用于預測植物年齡。在植物組織培養過程中，端粒長度也會變化。故無性繁殖植株生理年齡值得思考和研究。本文基于端粒長度探討了無性繁殖植株生理年齡。認為生理年齡較老供體可能會無性繁殖出“小老頭”無性系，端粒長度可能成為預測植物材料無性繁殖能力和愈傷組織再分化能力的有效新指標，老樹復幼和端粒長度的關系是一個很好的研究課題。此外，提出了植物愈傷組織需要足夠的時間來抹除外植體“痕跡”的新觀點。關于植物無性繁殖過程中的端粒長度，有很多問題亟待研究和探索。

端粒；離體快速繁殖；扦插；嫁接；生理年齡

Abstract: The change of telomere length during aging of plant cells has been found to be much more complicated than that in animals. It can be divided into the invariant group, the prolongation group, the shortening group and the circle change group. Nevertheless, the age of plants can also be predicted based on telomere length. Moreover, the telomere length can change during plant tissue culture. Thus, the physiological age of asexual plants is worth to be studied. In the article, the physiological age of asexual plants is discussed based on telomere length. It is concluded that the older donor might produce clone with small body but old physiological age, telomere length might be a novel reliable indicator for assessment the ability of both asexual propagation and callus redifferentiation of plants, the relationship between old-tree reinvigoration and telomere length might be a good research project. Furthermore, it is proposed that plant calli need enough time to erase the traces of the explants. Many problems about the telomere length during asexual propagation of plants are urgent to be researched and explored.

Keywords: telomere;invitrorapid propagation; cutting; grafting; physiological age

端粒是位于真核生物染色體末端的核蛋白結構，它由端粒DNA重復序列、組蛋白八聚體和蛋白端粒帽子共同形成[1-2]。大多數陸生植物的端粒DNA是擬南芥式的7核苷酸重復(TTTAGGG)n[3]，但是也有人類式重復等很多例外情況存在(表1)[2]。端粒能夠保護線性染色體不被內源核酸酶損傷，避免線性染色體被誤識為未配對的染色體斷片[2]；端粒與細胞分裂、細胞衰老及壽命有著密切的聯系[4]。在人類[5-6]和澳大利亞海獅等動物體細胞中[7-9]，端粒隨DNA復制和細胞分裂次數的增加而縮短。當端粒短到一定程度，細胞進入衰老期[10]。因此，人類和動物體細胞的端粒縮短被認為是老化的指標。雖然在大麥[11]和人參[9]等植物中也檢測到年齡和端粒長度呈顯著相關[4]，但是植物中端粒長度和年齡的關系卻遠比動物復雜得多。隨著植物年齡的增長和發育的進行，有些物種有些部位的端粒長度呈延長趨勢、有些縮短、有些基本不變，甚至有些呈現周期性變化(表2)?？傊?，不同植物物種、同一物種不同基因型、同一物種不同組織、同一物種不同分化程度的相同組織、不同環境及生理條件下的相同部位，端粒長度都可能存在差異[3,9]。盡管如此，針對有些多年生植物物種的研究發現，端粒長度可以用來預測植株的年齡。例如，2015年Liang等人建立了人參年齡和端粒長度相關的數學模型[9]；

表1 目前發現的陸生植物端粒DNA多樣性(非擬南芥式重復)Table 1 The current knowledge on telomere DNA diversity in land plants (The non-Arabidopsis-type of telomeric repeats)

2015年劉頔等人建立了油松端粒長度和樹齡的相關關系模型[4]。植物體的端粒調控存在復雜的機制：端粒酶可以在一定程度上維持或者延長端粒DNA的長度[22]；在缺乏端粒酶的情況下，端?？杀弧耙蕾囉谥亟M的替代機制”所延長[23]；新近研究發現多種表觀遺傳機制參與了端粒穩定性[24-25]。可見關于植物端粒長度的維持機制，仍有很多內容有待研究。

表2 目前發現的植物端粒長度隨年齡、發育和細胞分裂的變化情況)Table 2 The current knowledge on telomere length changes in plants during aging, development and cell division

植物離體快速繁殖，即植物組織培養，是植物無性繁殖的典范。它是利用植物細胞的全能性，在無菌條件下，對離體的植物器官、組織、細胞及原生質體進行培養，以獲得完整植株的技術。盡管體細胞無性系變異廣泛存在[26-29],較之有性繁殖技術，植物組織培養技術具備繁殖速度快，繁殖植株能在更大程度上保持母株的優良性狀等諸多優點[26]。在林業領域，植物離體快速繁殖具備更加重要的意義。因為林木通常具備生長周期長、子代性狀分離顯著等特點。一旦發現優良單株，比如雜種優勢成年優株，利用離體快速繁殖可以實現短期繁殖大量優良植株的目的。值得注意的是，2014年Aronen和Ryyn?nen研究發現隨著白樺愈傷組織離體培養時間的延長，其端粒長度呈逐漸縮短的趨勢[3]。又因為端粒長度也可以用于預測植物細胞的分裂能力和植株的年齡[4,9,30]，所以以上發現引發了我們對于無性繁殖植株生理年齡的思考，本文將圍繞端粒長度這條主線探討無性繁殖植株的生理年齡。

1 端粒長度與“小老頭”無性系

研究發現同一植株不同器官的端粒長度有所不同[3,9,17]，那么對于葉片細胞中端粒較短的植株。如果選用葉片作為外植體，葉片再分化產生的愈傷組織再分化產生植株的端粒長度與同等大小的實生苗相比會不會有所變化？愈傷組織可能的高端粒酶活性能在一定程度上使端粒的長度有所恢復甚至變得更長[17-19]，那么以葉片為外植體的不經過愈傷的直接器官或直接體細胞胚胎發生植株的端粒長度又會如何呢？如果葉片產生植株端粒長度比相應的實生苗短，是否證明葉片無性植株的生理年齡老于實生苗？本課題組先前的研究發現以大花君子蘭葉片作為外植體，通過直接器官發生路徑產生的植株存在生長異常緩慢的現象。這很可能是因為葉片直接發生植株的端粒長度較短、實際生理年齡較老。如果用于無性繁殖的外植體或插條取自百年老樹，“小老頭”無性系，即表現為“三歲之軀，百歲之身”的無性系，是否真的存在？如果存在，那么這種無性繁殖植株會成為典型“小老頭樹”且壽命會短于實生苗。

研究發現從生理年齡較老的器官或組織取外植體進行無性繁殖，其后代往往存在早衰或優勢衰退甚至喪失等現象，但是從接近根際部位或生理年齡較小的器官或組織取外植體獲得無性系較容易保持母株優良性狀，無性系苗木生長健壯、生機盎然[31]。由于一般樹木接近根際部位的莖干形成層的端粒長度較長[3,13]。所以推測較長的端粒賦予植物更佳的無性繁殖表現。這也證明由端粒長度預測細胞增殖能力和無性繁殖表現的可行性。然而，經過愈傷階段的間接器官/體細胞胚胎發生可能會是特例。因為已有研究證明合適的離體培養條件會使愈傷細胞的端粒長度延長至大于外植體細胞端粒的長度[17-19]。愈傷組織特有的端粒延長機制，恰恰解釋了為什么植物的分化外植體能夠返老還童式地再生出大量看似幼嫩的植株。

豆科固氮速生豐產樹種馬占相思(AcaciamangiumWilld.)的葉子具備二型性[32]。幼齡植株首先產生小葉數不同的復葉，然后產生中間過渡類型的葉狀柄，之后產生的為完全葉狀柄。完全葉狀柄被認為是馬占相思植株成熟的標志，而復葉被認為是馬占相思幼齡的標志[32-33]。研究發現取自幼齡馬占相思植株的莖外植體產生的幼齡形態的試管苗比例明顯高于成齡植株外植體產生的試管苗；成齡莖外植體也可產生幼齡形態試管苗，但其產生試管苗多數具備成齡形態的葉狀柄[32]。可能因為具備成齡特征試管苗的生理年齡大于具備幼齡特征的試管苗和實生苗的生理年齡。推測成齡莖外植體的葉腋分生組織端粒長度可能短于幼齡外植體，從而致使老齡外植體產生的試管苗多數具備成齡樹的特征——葉狀柄。因此，可以認為具備成齡形態葉狀柄的馬占相思試管苗生理年齡較老，為 “三歲之軀，百歲之身”的典范。比較研究馬占相思幼齡特征試管苗和成齡特征試管苗的壽命、端粒長度以及兩種葉子和外植體的端粒長度是很有必要的。

老樹樹干形成層端粒越往上越短[3,13]，越接近樹干基部的枝條扦插通常越容易生根[34]。那么是否可以認為樹干較上位置的側枝扦插得到的植株的生理年齡較老？推測這類扦插繁殖植株的生理年齡大于同等大小的實生苗。以上證據仍然支持“三歲之軀，百歲之身”。

總之，生理年齡較老的植物材料作為無性繁殖的供體，不經過愈傷組織階段產生的無性系的生理年齡可能遠遠大于同等大小的實生苗。盡管這類無性繁殖植株在初期看上去也是“嬌小”如童，但是從生理上來講它們可能已算“百歲老人”！

2 端粒長度與外植體無性繁殖能力

Liang等人建立了人參年齡和端粒長度相關的數學模型。根據此模型，可由人參主根上部的端粒長度預測人參年齡[9]。那么是否可以由端粒長度預測植物材料的無性繁殖能力呢？報道顯示歐洲赤松和白樺樹干下端形成層端粒長度長[3,13]；樹干下端枝用做插穗生根率相對較高[34]；越老的組織用于做外植體，離體再生能力越弱[28]；很多植物的端粒長度隨年齡和發育的進行而變化[4,9]。以上發現證明端粒長度可以反映植物/細胞的生理年齡，而植物材料/細胞的生理年齡又可以決定其無性繁殖能力。所以推測植物材料/細胞的端粒長度很可能成為預測其無性繁殖能力的有效新指標。

3 端粒長度與愈傷組織再分化潛能

研究發現大麥的端粒隨著分化而逐漸縮短，但是在大麥愈傷組織培養初期端粒縮短，之后又逐漸延長[18]。此外，幾乎所有植物的愈傷組織都要在培養一段時間之后才能分化[26,29]。這證明愈傷組織端粒長度很可能是愈傷再分化的限制因子之一。合適的愈傷培養時間使細胞有足夠的機會延長端粒、降低生理年齡，進而為再分化做好準備。因此在具體實驗過程中，應該選用端粒較長的愈傷組織用于誘導出芽。如果以上推論成立，愈傷端粒長度也將成為評判愈傷再分化能力的有效新指標。

研究發現可可再生植株葉片的甲基化狀態處于外植體供體植株葉片和雄蕊(外植體)之間。隨著愈傷組織培養時間的延長，愈傷再生植株葉片的甲基化狀態和SSR標記逐漸接近供體植株葉片[35]。即短期培養愈傷給出的無性植株的體細胞無性系變異頻率高，長期培養愈傷給出的植株的體細胞無性系變異頻率反而低。有報道顯示在端粒長度與生理年齡負相關的大麥愈傷組織培養初期端粒長度變短，而后隨著培養時間的延長端粒又逐漸變長[18]。如果以上關于端粒長度和體細胞無性系變異的兩項研究發現在植物界較具普遍性，則證明較長端粒對應較低的體細胞無性系變異頻率、較短端粒對應較高的體細胞無性系變異頻率。因為一般的DNA修復系統對端粒序列是無效的，所以端粒縮短也是總體DNA損傷積累的感受器[36]。故推測愈傷組織培養初期的端?？s短恰恰是DNA損傷和體細胞無性系變異積累的體現，而愈傷組織培養后期則相反。從這個角度來講，愈傷端粒長度的動態變化和愈傷產生植株的體細胞無性系變異情況是相吻合的。雖然前人和課題組前期研究證明植株再生不需要完全精準地模仿植物發育過程[29]，但是以上研究發現證明已經分化的外植體細胞需要足夠的時間和細胞分裂次數來盡可能清除以前細胞狀態下的 “痕跡”(包括端粒長度和甲基化狀態)。一定的愈傷培養周期提供了逐步抹除“痕跡”的機會。所以隨著愈傷培養時間的延長，痕跡清除越來越徹底，產生的植株也就可能越“保真”了。綜上所述，在進行組織培養實驗時，應該選擇脫分化徹底的、外植體“痕跡”盡可能少的愈傷組織來誘導芽叢或體細胞胚。

4 端粒長度與老樹復幼

植物和動物一樣，也會成熟和衰老[36]。但是植物和動物又不同——衰老植物會返老還童，比如老樹會通過嫁接復幼[37]。復幼的老樹不僅能恢復幼年期的生長勢、外表形態、生理生化狀態和細胞調控機制等，而且扦插生根能力也能完全恢復[38]?？梢姀陀桌蠘涞纳砟挲g大大降低，那么復幼老樹的端粒長度是否也恢復到幼齡時的狀態呢？復幼老樹的生理年齡具體又該如何計算呢？如果科學研究確實能夠證明復幼老樹端粒也恢復到幼齡狀態，那么進一步研究比較老樹接穗與幼樹砧木的端粒長度以及復幼老樹的端粒恢復機制，將是很有意思的研究課題。

5 前景和展望

目前關于植物端粒長度和年齡相關的研究報道仍然很有限[9, 36]。很多植物物種，尤其是多年生林木的無性繁殖植株的端粒長度及壽命有待研究。外植體的端粒長度是否可以用于預測再生能力，愈傷組織的端粒長度是否可以預測再分化能力，何時誘導愈傷組織再分化更合適？什么樣的愈傷細胞才能成為再分化的感受態細胞？嫁接誘導老樹復幼是否與端粒長度的變化有關？組培再生植株的幼齡化表型是否與端粒的長度有關？這些都是亟需研究和解決的科學問題。例如，僅僅對于用葉片作為外植體的離體快速繁殖，就有很多內容是值得研究的(表3)。尤其對于葉片端粒長度與植株其它部位存在明顯差異的物種。我們堅信隨著高通量測序等實驗技術手段的不斷進步，這些問題在不久的將來都將被揭曉。

表3 不同材料端粒長度比較可能揭示的內容

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(責任編輯：張 研)

ThePhysiologicalAgeofAsexualPlants——ThinkingArisefromTelomereLength

WANGQin-mei1,2，ZHANGZhi-hong1，CUIJian-guo2

(1.College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, Liaoning, China;2.College of Forestry, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, Liaoning, China)

S722.3

A

1001-1498(2017)05-0866-05

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.05.021

2016-02-06

國家自然科學基金項目(31600546)、中國博士后科學基金項目(2015M571330)、遼寧省教育廳一般項目(L2015487)、沈陽農業大學教師青年科研基金項目(20131002)、沈陽農業大學教學研究項目(2016-107)。

王欽美，博士，碩士研究生導師。主要研究方向：林木遺傳育種.E-mail : wqmwan@126.com 地址:110866，遼寧省沈陽市沈河區東陵路120號.

* 通訊作者：張志宏，教授，博士研究生導師。主要研究方向：果樹分子生物學.E-mail : zhang_sau@163.com 地址: 110866，遼寧省沈陽市沈河區東陵路120號.