LGR5在宮頸癌發生中的作用及機制初探

陳 慶， 李向紅， 趙金燕， 盧曉寧， 薛 翔

(西安交通大學第二附屬醫院婦產科， 陜西 西安 710004)

LGR5在宮頸癌發生中的作用及機制初探

陳 慶， 李向紅， 趙金燕， 盧曉寧， 薛 翔

(西安交通大學第二附屬醫院婦產科， 陜西 西安710004)

目的研究富含亮氨酸重復序列的G蛋白偶聯受體5(LGR5)在宮頸癌發生中的作用及機制。方法分別采用免疫組化、Western blot檢測LGR5、β-鏈蛋白(β-catenin)在正常宮頸、宮頸上皮內瘤變及宮頸癌組織中的表達，分析LGR5與宮頸癌臨床病理特征、β-catenin的關系；通過腫瘤球形成試驗觀察LGR5對宮頸癌發生的影響。結果LGR5、β-catenin在正常宮頸、宮頸上皮內瘤變及宮頸癌中的陽性率分別為17%(5/30)，65%(11/17)，84%(54/64)以及13%(4/30)，53%(9/17)，92%(59/64)，差異均具有統計意義(P<0.01)。LGR5表達與宮頸癌病理分級相關，而與患者年齡、臨床分期及淋巴轉移無相關性。宮頸癌組織中β-catenin與LGR5的表達呈顯著正相關(r=0.69，P<0.01)。LGR5過表達的人宮頸鱗癌細胞(SiHa細胞)腫瘤球形成率高于綠色熒光蛋白(GFP)對照組(P<0.01)，差異具有統計學意義。結論LGR5促進宮頸癌的發生，其機制可能與β-catenin高表達相關。

LGR5； 宮頸癌； β-catenin； 免疫組化； Western blot

宮頸癌是一種嚴重威脅女性健康的生殖系統惡性疾病，也是導致婦女癌癥死亡的主要病因之一。據報道，每年大約有27萬人死于宮頸癌[1]，尤其近年來，宮頸癌的發病呈現出低齡化趨勢。腫瘤的發生與一些干細胞相關蛋白的異常表達密切相關，富亮氨酸重復序列G蛋白偶聯受體5(leucine-rich-repeat-containing G-protein-coupled receptor 5, LGR5)是小腸及毛囊成體干細胞的一種新型標志物[2]。據報道，LGR5在結直腸癌[3]、肝癌[4]、基底細胞癌[5]等多種類型的腫瘤組織中出現表達升高。目前在宮頸癌組織中尚未見報道，為探討LGR5在宮頸癌中的表達及意義，本研究通過免疫組化、Western blot等技術分析了LGR5及β-catenin在宮頸癌組織中的表達及相關性。

1 材料及方法

1.1主要試劑與材料:LGR5蛋白抗體(Abnova,臺北)；β-catenin(santa cruz，美國)，β-actin單抗(santa cruz，美國)；DMEM(高糖)培養基(Sigma，美國)；SiHa細胞株(ATCC，美國)；羊抗鼠/兔SP試劑盒(博士德公司，武漢)；LGR5過表達及GFP對照載體

1.2臨床資料:64例宮頸癌，17例宮頸上皮內瘤變及30例正常宮頸組織標本分別收集于2009年1月至2012年12月期間于西安交通大學第一、二附屬醫院婦產科住院及門診患者，患者年齡31～71歲，平均年齡48.5歲。腫瘤患者術前經活檢確診，且術前均未接受放療及化療，手術行全子宮及雙側附件切除+盆腔淋巴結清掃術。其中正常宮頸來自于子宮肌瘤子宮全切患者。均為宮頸鱗癌，其中病理分級Ⅰ/Ⅱ為45人，Ⅲ為19人，浸潤深度為淺間質浸潤39人，深間質浸潤25人；宮頸上皮內瘤變為CINⅠ/Ⅱ為9人，CINⅢ為8人。

1.3免疫組化檢測LGR5、β-catenin蛋白:采用免疫組織化學染色法檢測正常宮頸、宮頸上皮內瘤變及宮頸癌組織中LGR5、β-catenin的表達。具體操作步驟參照Fan等[6]描述的方法進行。陽性結果判定：隨機觀察5個視野，將陽性細胞百分率分為5個等級，分別評分為：<5%(0)；5%～25%(1)；25%～50%(2)；50%～75%(3)；>75%(4)；按染色強度分為4個等級，分別評分為：陰性：背景色相同或不染色(0)，弱：染色呈淡黃色(1)，中：染色呈黃或棕黃色(2)，強：染色呈黃褐色(3)。最終評分按下列公式計算：

免疫反應評分(IRS)=陽性細胞百分率評分×染色強度評分。

IRS>3定義為陽性染色，其中IRS≤3為弱，36為強。

1.4SiHa細胞培養與轉染:SiHa細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養液，5% CO2培養箱中，37℃常規培養。采用脂質法轉染LGR5過表達及GFP對照質粒(本實驗室構建)至SiHa細胞，其操作步驟嚴格按照Lipofectamine 2000說明書進行。陽性克隆在熒光顯微鏡下可見綠色熒光表達。

1.5Western blot檢測LGR5、β-catenin蛋白:宮頸癌組織和細胞分別于蛋白裂解液中，在冰上裂解30min，4℃12000 rpm離心15min，提取蛋白。通過BCA法進行蛋白定量，按照Wang等[7]描述的方法進行western blot檢測。

1.6腫瘤球形成試驗:調整細胞密度為1×104個/mL，在24孔板中，提前加好0.5mL DMEM/F12干細胞培養基。在24孔板每孔加入10μL細胞懸液(即100個細胞)，十字晃動24孔板使細胞分散均勻，重新放置于37℃、含5%CO2的培養箱中培養。懸浮培養2周，每隔3d滴加0.2mL DMEM/F12干細胞培養基，在倒置顯微鏡下觀察腫瘤球的形成情況，并計算腫瘤球形成率。

2 結 果

2.1LGR5與β-catenin的表達:LGR5、β-catenin在宮頸癌組織(Squamous cervical carcinoma，SCC)中的表達均高于正常宮頸(Normal cervix，NC)及宮頸上皮內瘤變(Cervical intraepithelial neoplasias，CIN)，見圖1，且LGR5與β-catenin在NC、CIN及SCC的陽性率分別為17%(5/30)，65%(11/17)，84%(54/64)以及13%(4/30)，53%(9/17)，92%(59/64)，差異均具有統計意義(P<0.01)，表1。

表1 LGR5、β-catenin在正常宮頸、宮頸上皮內瘤變及宮頸癌組織的陽性表達

2.2臨床病理學特征分析:LGR5蛋白表達與宮頸癌病理分級相關(P=0.035)，與患者年齡、臨床分期及淋巴轉移無關，差異具有統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 LGR5表達與宮頸癌組織臨床病理特征的關系n(%)

注：a score ≤3, b score>3, c Chi-square test

圖1 LGR5、β-catenin在正常宮頸、宮頸上皮內瘤變及宮頸癌組織中的表達

圖2 宮頸癌中LGR5與β-catenin表達的相關性

A：Western blot檢測LGR5、β-catenin在宮頸癌組織中的表達；B：LGR5、β-catenin表達的相關性分析

2.3宮頸癌組織中LGR5與β-catenin的相關分析:Western blot結果顯示，宮頸癌組織中β-catenin表達有隨LGR5表達升高而升高的趨勢，見圖2A，通過定量分析發現，β-catenin與LGR5蛋白表達呈顯著正相關(r=0.69，P<0.01)見圖2B。

2.4腫瘤球形成試驗:LGR5過表達載體轉染至SiHa細胞，24h后，熒光顯微鏡下陽性克隆顯綠色熒光，經G418篩選，Western blot鑒定，獲得穩定過表達LGR5蛋白的SiHa(SiHa-LGR5)細胞株，見圖3。與對照組(SiHa-GFP)相比，SiHa-LGR5組腫瘤球形成時間早，生長速度快，見圖4A。培養12d后，SiHa-LGR5組腫瘤球形成率明顯高于SiHa-GFP組，經χ2檢驗，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖4 B，C。

圖3 LGR5過表達宮頸癌細胞系構建

A，LGR5過表達載體轉染SiHa細胞，GFP為綠色熒光蛋白；B，Western blot鑒定LGR5在轉染細胞的表達。

圖4 LGR5對SiHa細胞體外腫瘤球形成的影響

A，SiHa細胞腫瘤球的生長，200×；B-C，LGR5對SiHa細胞腫瘤球形成率的影響，100×；*P<0.05。

2.5β-catenin在LGR5過表達細胞中的表達:Western blot檢測顯示，β-catenin在SiHa-LGR5及SiHa-GFP細胞中的表達與LGR5的表達相一致，見圖5。

圖5 LGR5、β-catenin在SiHa細胞中的表達

3 討 論

LGR5是一種具有七次跨膜結構的G蛋白偶聯受體，屬于G蛋白偶聯受體超家族成員，在胚胎和器官的發育以及體內細胞信號轉導、代謝調節方面具有重要功能[8]，現已被確認為人類小腸及毛囊成體干細胞的重要分子標志。近年來，研究表明，LGR5與腫瘤的發生、發展存在密切關聯[3]。宮頸癌作為世界上嚴重威脅女性健康的第三大惡性腫瘤[9]，在全世界每年新發病例約有50萬左右，其中絕大部分發生在發展中國家，而我國宮頸癌的發病率則位居女性惡性腫瘤之首[10]。然而，目前關于宮頸癌的發病機制尚為完全闡明。

本研究發現，LGR5在正常宮頸、宮頸上皮內瘤變及鱗狀上皮宮頸癌組織中的表達是逐漸升高的；這提示LGR5可能參與宮頸癌的發生與發展。據文獻報道，LGR5在結直腸癌、胃癌[4]以及基底性小細胞肺癌[5]等腫瘤組織中均呈現表達增高，這與本研究結果相一致。臨床病理特征分析發現，LGR5表達與宮頸癌病理分級之間存在顯著正相關，而與患者年齡、臨床分期及淋巴轉移等臨床特征無明顯相關，這表明LGR5可能是一個促進宮頸癌發生、發展的癌基因。體外細胞培養試驗表明，LGR5-SiHa細胞的腫瘤球形成率明顯高于對照組，并且腫瘤球形成時間早，生長速度快，這表明LGR5促進宮頸癌的發生。

為探討LGR5促進宮頸癌發展的機制，本研究又分析了β-catenin在宮頸癌的表達。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的關鍵信號分子，其表達高低與Wnt/β-catenin信號通路活性密切相關。Wnt/β-catenin信號通路不僅在腫瘤的發生發展方面發揮著重要作用[11]，而且與LGR5也密切相關。有報道，LGR5是Wnt/β-catenin通路的重要靶基因[12]，Wnt/β-catenin信號通路激活，可引起LGR5表達的上調或下調[13]。然而，近年來也有研究報道LGR5是Wnt/β-catenin信號通路的激活劑，可增強Wnt/β-catenin信號通路的活性[14]。本研究發現，β-catenin在正常宮頸、宮頸上皮內瘤變以及宮頸癌組織中的表達也呈升高趨勢，并且在宮頸癌組織中與LGR5的表達呈明顯正相關，這表明LGR5的促癌作用可能與β-catenin的表達相關。此外，本研究還發現，β-catenin在LGR5-SiHa細胞中的表達高于對照組，與LGR5在細胞中的表達相一致，進一步說明LGR5促癌作用與Wnt/β-catenin信號通路激活有關。

綜上所述，本研究發現LGR5在宮頸癌組織中是高表達的，并能促進宮頸癌的發生，其機制可能與Wnt/β-catenin信號通路激活有關。這為探討LGR5在宮頸癌發生發展中的分子機制提供了線索，但宮頸癌中LGR5表達與Wnt/β-catenin信號通路激活的具體機制，尚需進一步深入研究。

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TheRoleandMechanismofLGR5inCervicalCarcinogenesis

CHENQing,LIXianghong,ZHAOJinyan,etal

(TheSecondAffiliatedHospitalofXi'anJiaotongUniversity,ShannxiXi'an710004,China)

Objective:To investigate the role and mechanism of LGR5 in cervical carcinogenesis.MethodsThe expression of LGR5 and β-catenin in normal cervix, cervical intraepithelial neoplasias and squamous cervical cancer were determined by immunohistochemistry and western blot, and analyze the relationship between LGR5 and clinical pathological features of cervical cancer and β-catenin expression. The effect of LGR5 on cervical carcinogenesis was examined using tumorsphere formation.ResultsThe positive rate of LGR5 and β-catenin in normal cervix, cervical intraepithelial neoplasias and cervical cancer were 17% (5/30), 65% (11/17), 84% (54/64) and 13%(4/30)，53%(9/17)，92%(59/64)，respectively. The difference was statistically significant (P<0.01). The expression of LGR5 was associated with pathological grade of cervical cancer, but not with patient's age, clinical stage and lymph node metastasis. β-catenin expression in cervical cancer was positively related to LGR5 expression(r=0.69, P<0.01). Moreover, the rate of tumorsphere formation of LGR5 overexpression SiHa cell was significantly higher than the GFP control group (P<0.01).ConclusionLGR5 and promoted cervical carcinogenesis and its mechanismmay be associated with high expressio0n of β--catenin

LGR5; Cervical cancer; β-catenin; Immunohistochemistry; Western blot

1006-6233(2017)09-1455-05

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.09.014

陜西省自然科學基金,(編號：2016JM8067)