犬新孢子蟲巨噬細胞轉移抑制因子生物學特性鑒定

王長江，曲光剛，金婷婷，武曰星，劉 慧，沈志強1,

(1.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；3.華中農業大學，湖北武漢 43000)

犬新孢子蟲巨噬細胞轉移抑制因子生物學特性鑒定

王長江2，曲光剛1*，金婷婷2，武曰星2，劉 慧3，沈志強1,2

(1.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；3.華中農業大學，湖北武漢 43000)

為了對犬新孢子蟲巨噬細胞轉移抑制因子(NcMIF)生物學特性進行鑒定，將NcMIF在大腸埃希菌中以3種不同的形式進行表達，三種蛋白分別為NcMIF(成熟的蛋白質)，NcMIFm(脯氨酸突變為甘氨酸)和NcMIFhis(在N端添加多組氨酸標記)，對三種蛋白的多聚體狀態、互變異構酶、氧化還原酶及是否與MIF受體(CD74)結合等進行分析。結果顯示這三種重組的NcMIFs (rNcMIF)均不具備互變異構酶和氧化還原酶活性；甘氨酸替代脯氨酸的重組NcMIF減少了二聚體和三聚物的形成；N端額外添加的HIS標簽增加了三聚物的形成；rNcMIF無法與重組人MIF競爭與MIF受體(CD74)結合，表明CD74不是NcMIF的結合受體；免疫熒光染色結果表明NcMIF定位于犬新孢子蟲速殖子的頂端。免疫電鏡結果進一步顯示NcMIF存在于微線體、棒狀體、致密顆粒及細胞核中。為進一步分析NcMIF在寄生蟲免疫逃逸過程中的作用提供參考。

犬新孢子蟲；巨噬細胞轉移抑制因子；互變異構酶；氧化還原酶

Correspondingauthor:QUGuang-gang,E-mail：guanggangqu@163.com

Abstract: NcMIF was cloned and expressed inEscherichiacoliin 3 forms, including NcMIF (mature protein), NcMIFm (mutation of proline-2 to glycine), and NcMIFhis (addition of a polyhistidine tag at the N-terminus). And then, the multimeric state, tautomerase and oxidoreductase of these proteins and binding ability with MIF receptor (CD74) were analyzed. Results showed that none of these recombinant NcMIFs (rNcMIF) had tautomerase and oxidoreductase activities. The glycine substitution for proline-2 of NcMIF resulted in decreased formation of dimers and trimers. The addition of N-terminal HIS-tag led to increased formation of trimers. rNcMIF was unable to compete with recombinant human MIF for a MIF receptor (CD74), suggesting that NcMIF does not bind to this MIF receptor. Immunofluorescence staining demonstrated that NcMIF was localized to the apical end ofNeosporacaninumtachyzoites. Immunoelectron microscopy further revealed that NcMIF was present in the micronemes, rhoptries, dense granules, and nuclei. This study provides a reference for further analysis of the role of NcMIF in the immune escape of parasites.

Keywords:Neosporacaninum; macrophage migration inhibitory factor; tautomerase; oxidoreductase

巨噬細胞轉移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)[1-2]是40年前首先被確定的細胞因子之一。MIF具有兩種潛在的生物學催化活性，即互變異構酶與氧化還原酶活性，并參與固有免疫應答及適應性免疫反應過程[3-4]。MIF最重要的作用是對巨噬細胞[5-6]和淋巴細胞反應進行調節以及對激素功能的調控[7-8]。此外，MIF還參與腫瘤的發展進程以及血管生成，并被證實能夠與細胞表面的CD74受體結合。

MIF不具有N端前導序列或者明顯的內部信號序列，但是免疫細胞或非免疫細胞能夠通過非傳統的無前導途徑分泌MIF。研究表明，與高爾基體相關聯的P115能介導MIF分泌[9]。化學交叉偶聯研究表明鼠MIF在生理環境下形成同型三聯體[10]，而平衡沉淀速率研究證明，人MIF在相同條件下往往形成單體、二聚體及三聚體的混合物[11]。X射線晶體學研究也支持人與鼠的MIF以同型三聚體的形式存在的結論[3, 12]。另外，這些MIF與細菌酶4-OT和5-CM-2HI在結構上屬于同一族[13]。N端第二位的脯氨酸在啟動蛋氨酸的水解作用下變化為N末端，它是細菌酶與MIF發生酶促反應后的關鍵殘余物[13-14]。MIF基因嵌入的小鼠免疫試驗表明MIF的互變異構酶活性與免疫調節作用之間存在相關性，這一相關性也表明了第二位脯氨酸的結構完整性介導蛋白質間的相互作用，而蛋白間的這種相互作用對于MIF的生物學活性是至關重要的[15]。

本研究通過對NcMIF的生物學活性分析，為進一步了解NcMIF在寄生蟲免疫逃逸過程中發揮的作用提供參考。

1 材 料

1.1 主要試劑及其配方 戊二醛(Sigma，St.Louis，MO)；NaBH4(Sigma，St. Louis，MO)；脫氧膽酸鈉(Sigma，St. Louis，MO)；蛋白用染色試劑盒(Sigma，St. Louis，MO)；加入異硫氰酸熒光素標記的抗兔IgG (Sigma，St. Louis，MO)；脂多糖(E.coliO111∶B4，Sigma-Aldridge，St. Louis，MO)；ELISA試劑盒(eBioscience Inc，San Diego，CA)

1.2 主要儀器 多孔載玻片(Erie Scientific Co.，Portsmouth，NH)；酶標儀(Molecular Devices SpectraMaxPlus384，Ramsey，MN)；分光光度計(Beckman，Atlanta GA)

2 方 法

2.1 NcMIF偶聯反應 2 μg/mL rNcMIF蛋白在pH6.5的50 mmol/L磷酸鉀緩沖液并含1%戊二醛的溶液中室溫孵育3 h。然后向交聯后產物加入NaBH4(2 mol/L)至終濃度50 mmol/L進行固定。20 min后加入終濃度為0.01%的脫氧膽酸鈉。利用三氯乙酸沉淀法濃縮蛋白，并在還原條件下通過SDS-PAGE進行分析。蛋白使用染色試劑盒銀染后可直接觀察結果。

2.2 犬新孢子蟲速殖子中NcMIF的免疫定位 用移液器分別向多孔載玻片的單孔中加入10 μL含有速殖子數為106/mL的PBS，自然干燥。玻片干燥后加入冷的甲醇浸泡5 min，然后加入含2%脫脂奶粉的PBS室溫封閉30 min。洗滌后向玻片中加入1∶100稀釋的兔抗NcMIF抗體或免疫血清，室溫孵育2 h。PBS洗滌5次后，加入異硫氰酸熒光素標記的抗兔IgG，室溫孵育1 h。PBS洗滌后玻片用Vectashield封固劑覆蓋，蓋上蓋玻片，使用熒光顯微鏡觀察圖像。

免疫金電鏡染色技術(IEM)參照Jenkins等人[16]文章中的方法，即將犬新孢子蟲速殖子用5000 g 離心2 min收集沉淀，然后將其重懸于100 μL含3%多聚甲醛、0.5%戊二醛的0.1 mol/L二甲砷酸鹽緩沖液固定劑中。經過5 min固定，采用5000 g離心5 min收集速殖子，使用二甲砷酸鹽緩沖液洗滌，然后將其混勻形成分散的小球。隨后將速殖子用梯度乙醇脫水處理，使用LR白色硬級丙烯酸樹脂浸潤過夜，55 ℃條件下熏蒸處理24 h。使用硅藻金剛鉆刀在切片機上制作90 nm厚度的截面，用200目的鎳網格收集。將這些網格用含0.1 mol/L甘氨酸和1%牛血清白蛋白的PBS浸潤，并用含脫脂奶粉的PBST浸潤。網格用含1∶100稀釋的羊抗NcMIF血清、兔抗NcMIF或先前免疫的血清浸潤，室溫孵育2 h。網格用PBS沖洗，然后使用含1∶100金標抗羊IgG或抗兔IgG的PBS孵育。經過PBS和水的連續洗滌后，自然干燥網格，用5%乙酸雙氧鈾著色30 min后用HT7700電子顯微鏡進行鏡檢。

2.3 互變異構酶和氧化還原酶分析 將48 μL的10 mmol/L鹽酸左旋多巴甲酯(L-3,4-dihydroxyphen ylalanine methyl ester)和32 μL的20 mmol/L高碘酸鈉加入到720 μL含有1 mmol/L EDTA和pH6.2的50 mmol/L PBS中，反應后生成L-多巴色素甲醇(L-dopachrome methyl ester)，以此為底物，利用分光光度計檢測NcMIF的互變異構酶活性。將該底物800 μL加入到1 mL的比色皿中，然后加入NcMIF至終濃度2 ug/mL，在A475波長處讀取吸光值20 min，同時設鼠的MIF為陽性對照。

NcMIF氧化還原酶作用主要通過催化還原胰島素實驗來進行檢測。將49 μL重組蛋白和6 μL 200 mmol/L還原型谷胱甘肽加到195 μL冰冷含有2 mmol/L EDTA和1 mg/mL胰島素的100 mmol/L PBS緩沖液(pH7.2)中，在23 ℃讀取650 nm的吸光值，共讀取96 min。

2.4 與人類CD74受體結合實驗分析 96孔細胞板上包被重組的可溶性CD74胞外域(sCD7473-232)，生物素標記的重組人類MIF(rhMIF，2 ng/μL)(Roche Applied Sciences)與純化的(未生物素標記的)不同濃度的rNcMIF或rNcMIFm一起同時加入三個孔中。通過加入鏈霉親和素堿性磷酸酶(R&D)檢測磷酸對硝基苯酯堿性磷酸酶來確定生物素標記rhMIF的量，在405 nm波長處讀數，讀數減去只有生物素標記的rhMIF孔的讀數。

3 結 果

3.1 rNcMIFs偶聯反應 為揭示rNcMIFs寡聚體形式，3種不同的rNcMIFs分別進行交聯，并在還原條件下電泳分析。交聯反應試驗表明沒有，經過偶聯的三種形式rNcMIFs蛋白主要呈現單體形式，但二聚體形式也較明顯(圖1)。rNcMIF呈現等量的單體、二聚體和三聚體，低水平的分子量更高的寡聚物也存在(圖1A)。rNcMIFm蛋白主要以單體形式存在，其中也包含有二聚體和三聚體(圖1B)。值得注意的是，rNcMIFhis蛋白主要存在形式為三聚體，還包括低水平的單體和二聚體以及高水平的寡聚體形式(圖1C)。

3.2 犬新孢子蟲速殖子的免疫定位 免疫定位結果顯示，兔抗犬新孢子蟲抑制蛋白[17]作陽性對照呈現綠色的熒光，僅使用PBS、山羊抗兔IgG-FITC、免疫前血清或不相關的免疫血清時觀察不到相似的熒光現象(圖2A，a～d)，而NcMIF組顯示NcMIF被緊密地定位在寄生蟲頂端末梢(圖2A，e和f)。免疫電鏡結果證明，NcMIF被特異性的定位在犬新孢子蟲棒狀體和微線體(圖2B，b～d)、密集顆粒(圖2B，e)和細胞核上(圖2B，f)。

3.3 rNcMIF不具有互變異構酶和氧化還原酶活性MIF具有互變異構酶活性，雖然它與MIF的生物學相關性還不明確。為確定復性或未復性的rNcMIF的酶活性，使用多巴色素底物進行互變異構酶分析。陽性對照鼠源MIF具有互變異構酶活性，0.6 μg/mL的濃度條件下可檢測到酶活性315 μmoLmin-1mg-1(圖3A)。然而rNcMIF或rNcMIFm在10 μg/mL濃度下復性之前或之后均沒有檢測到互變異構酶活性(圖3B)。rNcMIFhis在高濃度(10 μg/mL)下有很低的但可檢測到的互變異構酶活性，后被證實這是由于該蛋白純化時蛋白洗脫液中的咪唑導致的。

3.4 rNcMIF不能與人類MIF受體CD74結合 rNcMIF CD74受體結合試驗證明，rNcMIF和rNcMIFm都無法競爭人rhMIF與MIF受體CD74(外功能區73～232)結合(圖4)。

泳道1：用NaBH4固定蛋白而不用1%戊二醛處理；泳道2：用1%戊二醛處理蛋白而不用NaBH4固定；泳道3：蛋白用1%戊二醛處理后用NaBH4固定；泳道4：蛋白不做任何處理；M：單體；D：二聚體；T：三聚體。左側顯示為蛋白marker。Lane 1: protein fixed by NaBH4 without 1% glutaraldehyde; Lane 2: protein treated with 1% glutaraldehyde without NaBH4 fixation; Lane 3: protein treated with 1% glutaraldehyde followed by NaBH4 fixation; Lane 4: protein without any treatment. M, monomer; D, dimer; T, trimer. Molecular weight ladder is shown to the left.圖1 NcMIF(A)、rNcMIFm(B)和rNcMIFhis(C)的化學交叉偶聯及4%～12%銀染NuPAGE分析Fig 1 Chemical crosslinking of rNcMIF(A), rNcMIFm, and rNcMIFhis(C) and analysis by silver-stained 4%～12% NuPAGE

A：兔抗NcMIF血清作為一抗，山羊抗兔IgG-FITC作為二抗進行IFA檢測，不同情況下NcMIF的定位情況：(a)僅加入PBS不加抗體；(b)僅加二抗(1∶100稀釋)；(c)免疫前兔血清(1∶100稀釋)；(d)兔抗非犬新孢子蟲重組蛋白血清(1∶100稀釋)；(e)兔抗重組犬新孢子蟲抑制蛋白對照(1∶100稀釋)；(f)兔抗rNcMIF血清(1∶100稀釋)。B：用綿羊抗NcMIF作為一抗，兔抗綿羊IgG-gold作為二抗，通過免疫電子顯微鏡對NcMIF進行定位。R：棒狀體；M：微絲；A:頂端；N：細胞核；DG：致密顆粒。9a：放大10000倍；b-f：放大50000倍。A. IFA using a rabbit anti-NcMIF serum as primary antibody and goat anti-rabbit IgG-FITC as secondary reagent: (a) PBS alone without application of antibodies; (b) second antibody (1∶100) alone; (c) pre-immune rabbit serum (1∶100 dilution); (d) rabbit antisera to a non-N. caninum recombinant protein (beta-giardin of Giardia lamblia) (1∶100 dilution) as an irrelevant antibody control;(e) rabbit antisera to recombinant Neospora profilin (1∶100 dilution) as a positive control; (f) rabbit antisera against rNcMIF (1∶100). B. Localization of NcMIF by immunoelectron microscopy using sheep anti-NcMIF as primary antibody and rabbit anti-sheep IgG-gold as secondary antibody. R: rhoptry; M: microneme; A: apical; N: nucleus; DG: dense granule. a: ×10000; b～f: ×50000.圖2 間接熒光(IFA)(A)和免疫電鏡(B)在犬新孢子蟲速殖子中對NcMIF進行免疫定位Fig 2 Immunolocalization of NcMIF in Neospora tachyzoites by indirect fluorescence assay (IFA) (A) and immunoelectron microscopy (B)

A：0.5 μg/mL mMIF在多巴色素互變異構酶活性檢測中用作陽性對照；B：10 μg/mL rNcMIF和rNcMIFm的多巴色素互變異構酶活性。A: mMIF was used as a positive control in the dopachrome tautomerase activity with a final concentration of 0.5 μg/mL;B: rNcMIF and rNcMIFm with a final concentration of 10 μg/mL were assayed for the dopachrome tautomerase activity.圖3 mMIF(A)和rNcMIFs(B)的多巴色素互變異構酶活性Fig 3 Dopachrome tautomerase activity of mMIF (A) and rNcMIFs (B)

圖4 在與生物素標記rhMIF競爭條件下rNcMIF、rNcMIFm、rhMIF與人MIF受體功能區結合的能力Fig 4 Binding ability of rNcMIF, rNcMIFm, and rhMIF to the human MIF receptor ectodomain (sCD74) in vitro capture assay using biotinylated-rhMIF as competitor

4 討 論

本研究中，交聯反應試驗證明NcMIF呈現出與人類MIF相似的低聚物形式，第二位氨基酸由脯氨酸突變為甘氨酸時NcMIFm低聚物明顯增多，同時單個氨基酸的突變不利于MIF二聚體和三聚體的形成。此外，在N端額外添加His標簽的NcMIF三聚體聚合物明顯增加。這些結果表明改變MIF蛋白N-端氨基酸序列或對其進行化學修飾會明顯改變該蛋白的結構，但這一改變可能對蛋白功能的影響尚無法確定。在Bernacchi等[18]報道中指出MIF蛋白序列中脯氨酸的存在對蛋白的結構和聚合狀態至關重要，但是第二位脯氨酸的作用仍需要進一步驗證。

在互變異構酶活性方面，NcMIF在其氨基酸序列中含有與該活性相關的關鍵第二位氨基酸——脯氨酸，還含有對互變異構酶起到重要作用的五種氨基酸殘基中的三個相關殘基(Lys33，Il65，Tyr96)。互變異構酶活性是原生動物MIF具有的標志性功能，與原生動物相比，其他動物的MIF、NcMIF和NcMIFm均缺乏互變異構酶活性。NcMIF缺失這一活性的原因也許不是構象折疊導致的，因為我們嘗試對蛋白進行復性且復性后的蛋白仍不能催化底物。然而在本研究中我們檢測到NcMIFhis具有低水平的互變異構酶活性，但這之后被證實是因為在蛋白純化時低水平的咪唑的存在導致的。我們猜測雖然第二位脯氨酸對所有MIF同系物的互變異構酶活性都起到重要作用，但其它與互變異構酶活性相關的氨基酸殘基也許也發揮著至關重要的作用。對于NcMIF來說，由于缺少其它氨基酸殘基或序列，從而可能失去了互變異構酶活性。Sommerville等[19]報道稱重組的弓形蟲MIF(TgMIF)具有互變異構酶活性但水平較低，在37 ℃測得含量為19 μmolmin-1mg-1。而我們在分析NcMIF的互變異構酶活性時，采用了較低溫度從而降低了檢測的靈敏度，這可能部分說明為什么檢測不到NcMIF的互變異構酶活性。

同樣，NcMIF和NcMIFm也不具備氧化還原酶活性。這從Alam等[20]的闡述中可知，由于NcMIF缺乏對該酶功能起關鍵作用的兩個半胱氨酸中的一個，從而直接導致氧化還原酶活性的缺失。該酶活性的缺失也進一步解釋了NcMIF不與MIF靶向受體CD74結合的原因。雖然沒有證據表明犬新孢子蟲會傳染人類，但這一寄生蟲實際上可在體外侵染所有種類的細胞。另外，牛CD74與人類CD74表現出高度的氨基酸序列同源性，用于MIF結合試驗中的人類CD74片段與牛CD74相關序列的同源性在77%，說明了人類和牛CD74分子在該片段結構上的相似性。

NcMIF主要定位于速殖子頂端。免疫電子顯微鏡進一步揭示NcMIF定位在類似于棒狀體、微線體、致密顆粒、細胞核的結構上。需要特別注意的是NcMIF明顯存在于細胞核。近期Arnoys等[21]在研究中報道NcMIF以及其他物種的MIFs不含信號序列或核定位信號，但卻在細胞質、細胞核以及胞外間質大量存在。

報道已證明，利什曼原蟲和瘧原蟲的MIFs均具有生物學活性。然而我們研究發現NcMIF缺乏互變異構酶和氧化還原酶活性，同時缺乏與CD74等生物活性劑受體結合的能力，故推測NcMIF的功能可能僅限于調控犬新孢子蟲的生命周期，而不調控宿主與寄生蟲之間的相互作用。盡管如此，NcMIF在犬新孢子蟲發病機理方面的作用仍有待研究。下一步將做深入的比較研究，以闡明MIF的結構變化導致其相應功能變化的關系。

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(編輯：陳希)

FunctionalIdentificationofNeosporacaninumMacrophageMigrationInhibitoryFactorEnzyme

WANG Chang-jiang2，QU Guang-gang1*, JIN Ting-ting2，WU Yue-xing2，LIU Hui3，SHEN Zhi-qiang1,2

(1.ShandongBinzhouAnimalScience&VeterinaryMedicineAcademy,BinzhouShandong256600,China; 2.ShandongLvDuBio-ScienceandTechnologyCo.,LTD,BinzhouShandong256600,China; 3.HuazhongAgricultureUniversity,Wuhan430000,China)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.9.04

2017-06-26

A

1002-1280 (2017) 09-0018-07

S852.7

山東省自然科學基金資助項目(ZR2013CQ004)

王長江，碩士研究生，從事病原源性免疫調節因子免疫調節功能方面研究。

曲光剛。E-mail：guanggangqu@163.com