超高效液相色譜-串聯質譜法測定牛奶中三氯苯噠唑及其代謝物殘留量的研究

李小橋，歐陽吳莉，武 煊，王永紅

(重慶市動物疫病預防控制中心，重慶 401120)

超高效液相色譜-串聯質譜法測定牛奶中三氯苯噠唑及其代謝物殘留量的研究

李小橋，歐陽吳莉，武 煊，王永紅

(重慶市動物疫病預防控制中心，重慶 401120)

建立了牛奶中三氯苯噠唑及其代謝物三氯苯唑酮殘留量的超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)測定方法。樣品經乙酸乙酯提取后，正己烷除脂，經超高效液相色譜儀和C18色譜柱分離，以乙腈和5 mmol/L乙酸銨溶液為流動相進行梯度洗脫。加熱電噴霧負離子模式(HESI-)電離，選擇反應監測模式(SRM)檢測，外標法定量。結果表明：三氯苯噠唑和三氯苯唑酮標準溶液在5～500 μg/L范圍內呈現良好的線性關系，r2>0.99，方法檢測限為1 μg/kg，定量限為2 μg/kg。三氯苯噠唑和三氯苯唑酮在2～10 μg/kg添加水平范圍內的回收率為72.3%～110%，批內和批間變異系數均小于13.5%。該方法具有簡便快捷、靈敏度高、準確度高等優點。

三氯苯噠唑；三氯苯唑酮；牛奶；超高效液相色譜-串聯質譜

Abstract: An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was established for the determining of triclabendazole(TCB) and its metabolite ketotriclabendazole(KTO-TCB) in milk. The sample was extracted by ethyl acetate and purified by hexane，and then separated by a C18 column with gradient elution solvent of 5 mmol/L ammonium acetate and acetonitrile.The electrospray was operated in the negative ionization mode, TCB and KTO-TCB were identified under selected reaction monitoring (SRM). The method was quantified by external standard method.The results showed good linearity of TCB and KTO-TCB in the range of 5～500 μg/L with correlation coefficients(r2) above 0.99,The limit of detection was 1 μg/kg,and the limit of quantification was 2 μg/kg. The average recoveries of TCB and KTO-TCB at 2～10 μg/kg were 72.3%～110%,and the relative standard deviations of intra-and inter-batch were both less than 13.5%.The method is simple,rapid,sensitive and accurate.

Keywords: triclabendazole;ketotriclabendazole; milk; UPLC-MS/MS

三氯苯噠唑屬于新型的苯并咪唑類驅蟲藥，對牛、羊的肝片吸蟲、大片形吸蟲及前后盤吸蟲均有良好的殺滅效果，在我國廣泛應用于反芻動物肝片吸蟲病治療[1-3]。為有效的控制其在動物性食品中的殘留，我國農業部235號公告[4]規定了三氯苯噠唑殘留標志物三氯苯唑酮在牛羊的肌肉、肝臟、腎臟和脂肪組織的殘留限量。2014年6月20日，歐盟發布法規(EU)No676/2014[5]增加了三氯苯噠唑及其代謝物三氯苯唑酮在牛奶中殘留限量10 μg/kg，目前我國還未見到牛奶中三氯苯噠唑及其代謝物殘留檢測方法的報道，因此，建立一種快速準確的檢測方法十分必要。目前在動物性食品中提取三氯苯噠唑及其代謝物主要使用有機溶劑，如甲醇、乙腈、乙酸乙酯等[1-3,6,7]。已報道檢測動物性食品中三氯苯噠唑及其代謝物的方法有HPLC-UV[1,6,8]和UPLC-MS/MS[3.9-11]法，HPLC-UV法前處理較為繁瑣、靈敏度低且定性不夠準確，UPLC-MS/MS靈敏度高、定性準確，適合牛奶中三氯苯噠唑及其代謝物檢測。本文旨在建立一種牛奶中三氯苯噠唑及其代謝物的UPLC-MS/MS檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜儀：TSQ Quantum，美國Thermo Scientific公司；色譜柱：Thermo Gold C18色譜柱(100 mm×4.6 mm,2.1 μm)，美國Thermo Scientific公司；電子天平：AE250，瑞士Mettler公司；旋轉蒸發儀：Laborota4000型，德國Heidolf公司；高速冷凍離心機：SIGMA-3K30，德國SIGMA公司；渦旋振蕩儀：SIR4，德國IKA公司；空氣搖床：KS260，德國IKA公司；氮吹儀：TTL-DCII型，北京同泰聯科技發展公司；甲醇、乙腈為色譜純，均購自Fisher公司；正己烷、乙酸乙酯為分析純，均購自重慶邁克公司。

對照品：三氯苯噠唑對照品，批號H0421108，含量99.8%，購于中國獸醫藥品監察所；三氯苯唑酮對照品，批號281527，含量99.0%，購于德國WITEGA公司。

標準溶液配制：稱取三氯苯噠唑和三氯苯唑酮對照品10 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，分別配制成1 mg/mL的標準儲備液，-20 ℃保存3個月。分別吸取三氯苯達唑和三氯苯唑酮標準儲備液1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成濃度為10 μg/mL的混合標準工作液，4 ℃保存7 d。分析時再用流動相稀釋成適當濃度的混合標準工作液。

基質匹配標準工作曲線配制：將7份空白牛奶樣品按照1.2.3項樣品前處理得基質提取液，將濃度為10 μg/mL的混合標準工作液用基質提取液稀釋成濃度為5、10、20、50、100、200、500 μg/L的基質匹配標準工作曲線。

1.2 儀器分析條件

1.2.1 液相色譜 色譜柱為Thermo Hypersll Gold C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)；流動相A相為乙腈；B相為5 mmol/L乙酸銨溶液；流動相梯度洗脫程序：0～1.5 min，A相由55%變為80%，1.5～4 min為80%，4.1～7 min保持為55%；流速為0.25 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

1.2.2 質譜條件 加熱電噴霧負離子源(HESI-)；噴霧電壓-2500 V；離子傳輸管溫度350 ℃；蒸發氣溫度280 ℃；鞘氣壓力：30 Arb；輔氣壓力：25 Arb。選擇反應監測三氯苯噠唑和三氯苯唑酮定性離子對，透鏡電壓和碰撞能量見表1，一級質譜圖見圖1。

1.2.3 樣品前處理 稱取試樣(5±0.05)g于50 mL塑料離心管中，加入乙酸乙酯20 mL，渦旋混勻后，高速振蕩10 min，10000 r/min離心8 min，上清液轉移至100 mL雞心瓶中，重復提取一次，合并上清液于45 ℃下旋轉蒸發至干。向雞心瓶中依次加入1 mL甲醇和3 mL甲醇飽和的正己烷，充分溶解，將溶解液轉移至15 mL離心管中，重復一次，合并兩次溶解液，中速振蕩5 min，5000 r/min離心5 min，棄掉上層溶液，下層溶液于45 ℃下氮氣吹干，加入1 mL流動相(A∶B=55∶45)溶解，過0.22 μm微孔濾膜后供UPLC-MS/MS分析。

表1 三氯苯噠唑和三氯苯唑酮的定性、定量離子對、透鏡電壓和碰撞能量Tab 1 Confirmation and quantification ions,Tube lens voltage and cllision energy of Triclabendazole and Ketotriclabendazole

*quantification ions

圖1 三氯苯噠唑和三氯苯唑酮在ESI—條件下一級質譜圖Fig 1 the Q1 Mass Spectrometry of Triclabendazole and Ketotriclabendazole in negative ion mode

2 結果和分析

2.1 線性范圍 將1.1項中配制的線性范圍為5～500 μg/L基質匹配標準工作曲線上機測定，以定量離子質量色譜峰面積為縱坐標，對照溶液的質量濃度為橫坐標來繪制標準曲線，獲得外標法標準曲線A三氯苯噠唑=21462.5+8481.61C，相關系數r=0.9971，A三氯苯唑酮=1264.63+620.622C，相關系數r=0.9938。

2.2 方法回收率與精密度 采用標準添加法，在空白牛奶中添加2、5、10 μg/kg濃度的三氯苯噠唑及三氯苯唑酮進行加標回收率實驗，考察方法的準確性和精密度，每批次同一濃度做5次平行實驗，重復3次，結果見表2。本方法在空白牛奶中的平均回收率為72.3%～110%， 批內、批間相對標準偏差均≤13.5%。

表2 牛奶中三氯苯噠唑和三氯苯唑酮回收率試驗結果(n=5)Tab 2 Spiked recoveries and RSD of Triclabendazole and Ketotriclabendazole in milk(n=5)

2.3 檢測限與定量限 采用空白組織中添加目標化合物的方法, 以特征離子質量色譜峰信噪比S/N>3為方法檢測限，S/N>10為方法定量限。牛奶中三氯苯噠唑和三氯苯唑酮檢測限均為1 μg /kg，定量限均為2 μg/kg，空白牛奶及其添加檢測限濃度色譜圖見圖2。

3 討論與小結

3.1 前處理方法優化 三氯苯噠唑屬于弱堿性藥物，溶于甲醇、乙醇、乙腈和乙酸乙酯等有機溶劑。本實驗選擇乙腈和乙酸乙酯作為提取溶劑，二者回收率相當，雖然乙腈提取牛奶時油脂較少，但由于牛奶中水分較多，需要在牛奶中加氯化鈉等進行鹽析分層，否則乙腈提取液在旋轉蒸發過程中很難蒸發至干，步驟較為繁瑣，因此選擇乙酸乙酯作為提取液。三氯苯噠唑及其代謝物常用凈化方法有液液萃取和液固萃取法，李丹[6]等發現三氯苯噠唑和三氯苯唑酮極性差異較大，在C18、HLB、MCX、氰基柱(CN-E)和硅膠柱等固相萃取柱上保留效果均不理想。仲鋒[1]等在羊肌肉、肝臟、腎臟中使用乙酸乙酯作為提取溶劑，脂肪組織使用乙腈進行提取。凈化方法目前有液液萃取和液-固萃取，李丹[6]等發現三氯苯噠唑和三氯苯唑酮極性差異較大，常用固相萃取柱對二者回收率不能兼顧。因此，本研究采用液液萃取法，利用甲醇飽和的正己烷進行凈化除脂，簡便快捷，回收率和凈化效果均比較理想。

3.2 基質效應考察 稱取5份空白樣品按1.2.3項方法處理后，加入10 μg/L標準溶液制成基質匹配標準溶液，再與對應濃度標準溶液上機進行測定。比較發現兩種藥物均為基質減弱效應，其中，三氯苯唑酮峰面積降低約50%，三氯苯噠唑降低約20%，這是本方法選擇基質匹配標準溶液作為校準結果的目的。

3.3 液相色譜條件優化 在HESI-條件下，一般選擇乙酸銨溶液或純水作為流動相，本方法在乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液條件下，兩種化合物靈敏度和峰形最好。由于三氯苯噠唑和三氯苯唑酮極性差異較大，本實驗考察了兩種化合物在C18色譜柱上保留情況，經研究發現，三氯苯噠唑極性較小，當有機相高達80%時才能較快地將三氯苯噠唑洗脫。

3.4 質譜條件的優化 Cai[3]等報道在ESI+條件下，三氯苯噠唑及其代謝物三氯苯唑砜、三氯苯唑亞砜和三氯苯唑酮均能獲得較高響應值。本實驗分別注射1 μg/mL三氯苯噠唑和三氯苯唑酮標準工作液，在加熱電噴霧正離子HESI+條件下，三氯苯噠唑響應值可達E6，但是，三氯苯唑酮響應值較差，兩者相差近1000倍，這與Cai等研究結果差異較大。但在加熱電噴霧負離子源HESI—條件下，三氯苯噠唑和三氯苯唑酮均能獲得較高響應值，與Jedziniak P[12]等報道結果一致。分析原因可能是三氯苯唑酮分子中含有三個氯離子，在負離子模式下響應值增強。

圖2 空白牛奶中添加1μg/kg濃度水平(A)和空白牛奶(B)中三氯苯噠唑和三氯苯唑酮色譜圖Fig 2 Chromatographic trace of Triclabendazole and Ketotriclabendazole in negative milk spiked at 1μg/kg(A) and negative milk(B)

三氯苯噠唑和三氯苯唑酮分子式中均含有三個氯離子，而氯元素在自然界有兩種天然同位素35Cl(75.77%)和37Cl(24.23%)[13]，從三氯苯噠唑和三氯苯唑酮的一級質譜圖可以看出，兩種化合物母離子有幾處相對豐度較高，因此本實驗選擇三氯苯噠唑356.7和358.6為母離子，通過二級質譜打碎后得356.7>341.8和358.6>343.7，鑒定積分為5，完全滿足歐盟2002/657/EC[14]技術文件對獸藥殘留確證提出的鑒定積分要求。同理，三氯苯唑酮采用相同方法。

本文建立了牛奶中三氯苯噠唑及其代謝物的超高效液相色譜-串聯質譜檢測法。樣品經乙酸乙酯提取，正己烷除脂，在HESI-下選擇反應監測模式檢測樣品。三氯苯噠唑和三氯苯唑酮在2、5、10 μg/kg加標水平下平均回收率在72.3%～110%之間，相對標準偏差≤13.5%，方法檢測限為1 μg/kg，表明該方法靈敏度高，穩定可行，前處理過程簡便快捷，滿足我國有關食品檢測法規要求。

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(編輯：侯向輝)

DeterminationofTriclabendazoleandItsMetabolitesResiduesinMilkbyUltraPerformanceLiquidChromatography-TandemMassSpectrometry

LI Xiao-qiao,OU YANG Wu-li,WU Xuan,WANG Yong-hong

(ChongqingAnimalDiseaseControlCenter,Chongqing401120,China)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.9.08

2017-04-04

A

1002-1280 (2017) 09-0043-06

S859.84

李小橋，碩士，獸醫師，從事獸藥殘留分析研究。E-mail：lixiaoqiao008@163.com