抗博爾納病病毒磷蛋白單克隆抗體的制備及鑒定

馬麗華，鄧 榕，徐曉艷，楊宏靜，謝 鵬

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2017.09.005

抗博爾納病病毒磷蛋白單克隆抗體的制備及鑒定

馬麗華1,3，鄧 榕2，徐曉艷1,3，楊宏靜1，謝 鵬3

目的以重組的博爾納病病毒(BDV)磷蛋白(p24)為免疫原制備單克隆抗體，并鑒定其特異性。方法以純化后的重組BDVp24免疫小鼠，將骨髓瘤細胞與其脾細胞進行融合，經ELISA法篩選出分泌抗p24單抗的細胞株，并對其進行克隆與亞克隆培養，將最終獲得的其中2株細胞株分別注入小鼠腹腔制備單抗，經親和純化法純化后，采用ELISA法測定效價，利用蛋白免疫印跡和免疫熒光鑒定其特異性。結果建立了2株穩定分泌抗p24單抗的雜交瘤細胞株，抗體亞類均為IgG1型。純化后的腹水抗p24單抗純度為98%和93%，ELISA 效價在1∶81 000以上,該抗體均能識別重組p24蛋白和BDV感染人類少突膠質細胞(Oligodendroglia cell，OL細胞)所表達的p24蛋白。結論成功制備了靈敏性高、特異性好的抗BDVp24單抗，為博爾納病病毒診斷方法的研制及感染機理的研討提供依據。

博爾納病病毒;磷蛋白類;單克隆抗體

博爾納病病毒(Borna disease virus, BDV)是博爾納病毒科博爾納病毒屬的唯一成員，是一種人畜共患病病原體，易感染多數恒溫動物，包括人類在內[1]，其感染地域廣泛，在全世界均有報道[2]。BDV具有高度的嗜神經性[3]，感染后主要表現為精神、行為異常，稱為Borna病。BDV最早于戰馬中引起致死性腦膜腦炎的暴發流行，而后在雙向情感障礙、強迫癥患者及精神分裂癥患者體內成功分離出BDV[4-5]，許多實驗也證明BDV 與人類神經精神疾病密切相關[6-7]。Borna病病死率非常高[8]，目前，治療Borna病最有效的方法是對癥和支持治療。避免接觸病毒來源是預防Borna病唯一的方法，因此建立BDV的實驗室檢查方法顯得尤為重要。

BDV基因組長8 900 bp，其6 個開放式讀碼框(Open reading frame，ORF)分別編碼核蛋白(N，p40)、磷蛋白(P，p24)、基質蛋白(M，p16)、糖蛋白(G，p57)、L-聚合酶(L，P190)和非糖基化蛋白(X，p10)[9]。與其他很多RNA病毒不一樣，在不同感染區域、不同感染時間、不同宿主類別及不同病毒株，BDV的核酸序列均具有高度的保守性[10]，其中保守性最大的是ORFⅡ，它編碼的p24 蛋白抗原性極強，可能在BDV感染中起重要作用[11]，且p24 蛋白一直處于表達狀態[12]，因而，可成為檢測BDV的重要診斷指標。單克隆抗體具有特異性強、靈敏度高、重復性好、且能大量制備等特點，廣泛應用于免疫組化、酶聯免疫吸附試驗和放射免疫分析等技術。本研究制備并純化了特異性抗BDVp24單抗，為博爾納病病毒診斷方法的研制及感染機理的研討提供依據。

1 材 料

1.1 實驗動物 6～8周齡SPF級雌性BALB/c小鼠，由重醫醫科大學實驗中心豢養。

1.2 病毒與細胞 OL細胞和BDV由德國HannsLudwig教授贈予；小鼠骨髓瘤細胞SP2/0購自南京金絲瑞公司;單皰病毒1型(HSV-1 )F株由重慶醫科大學神經科學研究中心保存。1.3 主要試劑 重組BDV p24蛋白和重組BDVp40蛋白由本課題組前期制備;弗氏佐劑和PEG4000、Trien-X100購自Sigma ；DMEM培養液和PBS購自HyClone；熒光標記的羊抗鼠IgG、HRP標記的羊抗鼠IgG 、pNPP顯色液和TMB購自上海生工;蛋白marker購自Fermentas公司;聚偏二氟乙烯膜購自Millipore公司;NaOH和4%多聚甲醛為國產分析純；HisTrapTM親和柱購自GE公司。

2 方 法

2.1 動物免疫 將重組BDV p24蛋白作為免疫原，選取5只SPF級6～8周齡的雌性BALB/c小鼠進行免疫。初次免疫時，每只小鼠的免疫劑量是100 μg，p24蛋白與弗氏完全佐劑1∶1乳化均勻，注射入小鼠腹腔。2周后進行第2次免疫，免疫劑量50 μg/只，使用弗氏不完全佐劑進行乳化，腹腔注射。21 d后采用相同的方法進行第3次免疫。7 d后取尾靜脈血用ELISA法測血清中抗體效價，選取效價水平達到要求的小鼠，2周后不加佐劑進行最后一次加強免疫，3 d后取脾細胞。

2.2 雜交瘤細胞株的建立 將凍存的骨髓瘤細胞SP2/0復蘇后，培養于37 ℃含 5% CO2的培養箱中，選擇存活率高且處于對數生長期的細胞進行后期融合。融合前1 d取SPF級小鼠腹腔巨噬細胞作為飼養細胞，培養于96孔板中。融合當天將骨髓瘤細胞SP2/0和加強免疫后取的小鼠脾細胞按1∶5的比例，在50%PEG4000的作用下進行融合，用 HAT 培養液重懸加到預先準備好的飼養細胞板中，于37 ℃ 5% CO2中培養。

觀察雜交瘤細胞生長情況，用ELISA法檢測其上清，篩選出分泌抗p24單抗的陽性孔。用有限稀釋法對篩選得到的陽性孔進行克隆，再用ELISA法對細胞培養上清進行檢測，對陽性孔再進行亞克隆，直至陽性孔為 100%。

2.3 單克隆抗體亞類鑒定 使用SBA公司抗體亞類測定試劑對分泌的單克隆抗體進行亞類的鑒別。

2.4 單克隆抗體的腹水制備與純化 將液體石蠟以0.5 mL/只注入經產BALB/c小鼠腹腔，1周后再將處于對數生長期的雜交瘤細胞按每只小鼠1×106個細胞的量注入小鼠腹腔。約 7～10 d后，小鼠的腹腔極度膨脹時采集腹水，進行離心取上清，分裝后凍存。將制備的腹水單抗采取protein G親和純化法純化，經SDS-PAGE和ELISA檢測后分裝于-20 ℃保存。

2.5 腹水型單克隆抗體純化后效價的測定 將重組BDV p24蛋白用PBS(pH7.4)包被緩沖液稀釋至10 μg/mL，酶標板每孔加入 100 μL稀釋液，37 ℃孵育2 h。用300 μL洗滌液(含 0.9% NaCl，0.05% Tween-20，0.02% 疊氮化鈉)洗滌3次，每孔加300 μL封閉液于37 ℃孵育1 h。用300 μL洗滌液洗滌3次后，每孔加入100 μL從 1∶1 000起用PBS(pH7.4)按3倍梯度遞增稀釋的腹水抗體， 37 ℃孵育1 h。用300 μL洗滌液洗滌4次，每孔加入100 μL 1∶25 000稀釋的HRP 標記的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h。洗滌液洗滌4次，每孔加入pNPP顯色液100 μL，避光反應約10 min。最后加入3 mol/L的NaOH 50 μL，測出A450值。

2.6 單克隆抗體特異性的鑒定

2.6.1 蛋白免疫印跡分析 將OL細胞培養于含5% CO237 ℃培養箱內，當細胞密度達 90%時，按細胞數和病毒數1∶1接種BDV，換液傳代培養15 d。待細胞長滿單層時，洗滌3次后用含PMSF的裂解液裂解細胞30 min，于4 ℃，12 000 r/min離心5 min，分別收集感染BDV和正常OL細胞的蛋白。將收集到的蛋白與重組BDVp40蛋白和p24蛋白各取50 μg，煮沸5 min后，12 000 r/min離心1 min,分別取2μL上清，經SDS-PAGE分離蛋白，電轉移至聚偏二氟乙烯膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗抗p24單抗孵育2 h，洗滌3次，加入二抗HRP標記的羊抗鼠IgG孵育2 h，洗滌3次，用ECL 發光試劑盒發光，凝膠成像照相。

2.6.2 免疫熒光分析 6孔板用4%多聚賴氨酸包被，培養正常OL細胞和感染BDV的OL細胞，每組3個孔，培養于含5% CO237 ℃的培養箱中。細胞鋪滿瓶底時，PBS洗滌5 min，重復3次，加入4%多聚甲醛，15 min后棄之，加入0.2%Trien-X100裂解細胞膜，室溫下孵育10min。洗滌3次，加入5%脫脂奶粉溶液，1 h后加入純化的抗p24單抗，4 ℃孵育過夜,37 ℃復溫40min。PBS洗滌3次，避光加入熒光標記的羊抗鼠IgG，于37 ℃溫箱作用1 h。PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察。用HSV-1感染OL細胞，重復上述步驟。

3 結 果

3.1 免疫小鼠血清抗體效價的測定 第3次免疫后的第7 d用ELISA法測小鼠血清中抗體的效價，5只小鼠的血清抗體效價均在1∶27 000以上，滿足細胞融合要求。選擇健康狀況最好、效價較高的4號和6號小鼠進行加強免疫。

3.2 雜交瘤細胞株的篩選與克隆 細胞融合后，用ELISA篩選出OD值高且團小的雜交瘤細胞株，采用有限稀釋法進行克隆及3次亞克隆，獲得穩定分泌抗BDVp24單抗的雜交瘤細胞株3株。以骨髓瘤細胞SP2/0上清為陰性對照，采用間接 ELISA 法檢測其培養上清單抗的效價為1∶2 430以上(表1)。選取3E9B2和3B10A4雜交瘤細胞株進行凍存，復蘇后培養，細胞生長良好，傳20 代以上，都能穩定分泌抗BDVp24單抗。

表1 細胞培養上清抗BDVp24單克隆抗體效價
Tab.1 Titer of BDV p24 monoclonal antibody in cell culture supernatant

Dilutedtimes1∶101∶301∶901∶2701∶8101∶2430NegativeTiter3E9B21.8831.8171.7121.5451.1931.0850.082>1∶24303B10A42.2091.4310.8520.8420.8260.5830.082>1∶24301A6G111.8011.7841.6111.3320.740.2580.082>1∶2430

3.3 單克隆抗體亞類的鑒定結果 通過單克隆抗體亞類鑒定分析得出IgG1的OD值均明顯高于其他亞類的OD值，所以本實驗獲得的抗BDVp24單抗的抗體亞類均為IgG1，輕鏈為K。

3.4 腹水型單克隆抗體純化后SDS-PAGE結果 將雜交瘤細胞3E9B2和3B10A4分別注入小鼠腹腔產生的抗BDVp24單克隆抗體純化后SDS-PAGE結果如圖1所示，純化效果良好純度分別達到了 98%和93%。

3.5 腹水型單克隆抗體純化后效價測定結果 小鼠腹腔注射3E9B2和3B10A4雜交瘤細胞產生的抗BDVp24單克隆抗體純化后，其效價經ELISA法檢測均在8.1×104以上(表2)。

圖1 腹水單克隆抗體的SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE of purified monoclonal antibodies from ascites

表2 腹水型單克隆抗體純化后ELISA結果
Tab.2 Titer of purified monoclonal antibody in ascites

3.6 腹水型單克隆抗體純化后特異性的鑒定

3.6.1 蛋白免疫印跡分析 蛋白免疫印跡實驗顯示，以純化抗p24單克隆抗體作為一抗，感染BDV的OL細胞和重組p24蛋白處有明顯特異的條帶，而正常OL細胞和重組p40蛋白處無條帶 (圖2)。表明制備的抗p24 單抗不僅可特異性結合BDV重組p24蛋白,且能特異性結合細胞所表達的p24 蛋白，特異性好。

1: recombinant p24; 2: OL cells infected with BDV; 3: normal OL cells; 4: recombinant p40圖2 抗BDVp24單抗的蛋白免疫印跡分析結果Fig.2 Western blot analysis of BDV p24 monoclonal antibody

3.6.2 免疫熒光分析 以純化后的抗p24單抗為一抗，熒光標記的羊抗鼠IgG為二抗，熒光顯微鏡下，感染BDV的OL細胞發出明顯的綠色熒光，而感染HSV-1的OL細胞和正常的OL細胞無熒光信號。說明抗p24單抗能特異地結合細胞所表達的p24蛋白，特異性好(圖3)。

4 討 論

BDV宿主種類多，感染地理分布廣，病死率高，為預防BDV可能引發的爆發流行，建立該病毒的實驗室檢查方法顯得尤為必要[13]。另有研究者提出，雖然BDV有著廣泛的宿主，但馬、綿羊外的動物感染后發病率較低，認為臨床上易誤診及漏診[14]，因此需要建立高靈敏度和特異性的診斷方法。

A: OL cells infected withHSV-1; B: OL cells infected with BDV; 3: normal OL cells圖3 抗p24單抗的免疫熒光分析結果(SP染色，×200)Fig.3 Immunofluorescence analysis of monoclonal antibody (SP staining, ×200)

病毒檢測公認的金指標是病毒分離的，但病毒分離方法較復雜且敏感性較低，而BDV感染時病毒顆粒較少，且為非溶細胞性感染，不易分離[5]。快捷、簡單、特異和敏感是血清免疫學檢測方法的優點，可作為診斷 BDV感染的一種重要方法。

在機體感染過程中p24蛋白持續表達，且抗原性較強[13]，所以，在本實驗中我們以前期制備并純化的p24蛋白(純度>85%)為免疫原制備抗BDVp24單抗[15]。本研究選取雌性的6～8周齡Balb/c小鼠，經3次免疫后小鼠血清抗體效價達萬時，采用腹腔注射加強免疫后3 d取脾細胞與對數生長期的骨髓瘤細胞SP2/0進行融合，通過間接ELISA法反復篩選，通過有限稀釋法克隆，最后獲得3株穩定分泌抗BDVp24單抗的細胞株，且抗體亞類均為IgG1型。2株單抗3E9B2和3B10A4的小鼠腹水純化后 ELISA 效價在1∶81 000以上，靈敏度較高。免疫熒光與蛋白免疫印跡分析顯示，制備并純化的抗BDVp24單抗不但能與重組p24蛋白發生特異性結合，而且能與BDV感染的OL細胞所表達的p24蛋白發生特異性結合。

綜上所述，本實驗順利制備了靈敏度高、特異性好的抗BDVp24單抗，為博爾納病病毒診斷方法的研制及感染機理的研討提供依據。

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PreparationandidentificationofmonoclonalantibodyagainstphosphoproteinofBornadiseasevirus

MA Li-hua1, DENG Rong2, XU Xiao-yan1,3, YANG Hong-jing1, XIE Peng3

(1.DepartmentofBasicMedicine,ChongqingThreeGorgesMedicalCollege,Wanzhou404120,China;2.DepartmentofNeurology,ChongqingThreeGorgesCenterHospital,Wanzhou404120,China;3.InstituteofNeuroscience,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

In order to prepare the monoclonal antibodies (MAbs) by the recombinant phosphoprotein (p24) of Borne disease virus (BDV) as immunogen, the spleen cells of immunized balb/c mice with the recombinant BDV p24 were fused with the myeloma cells SP2/0. The hybridoma cell lines secreting MAbs against p24 were obtained after selected by indirect ELISA and subcloned for 3 times. The MAbs were prepared by intraperitoneal injection in mice, purified by affinity chromatography, identified by western blot and immunofluorescence assay (IFA) for specificity. The purified MAbs against BDV p24 from ascites belonged to IgG1 showed a purity of 98% and 93%, and a titer of 1∶81 000, and specific reaction with the BDV p24 restructured and expressed in Oligodendroglia cells (OL). The MAbs against BDV p24, with high specificity and sensitivity, were prepared successfully, which laid a basis for the study of diagnostic reagents and pathogenic mechanism of BDV.

Borna disease virus (BDV); phosphoproteins; monoclonal antibody

Xie Peng, Email: xiepeng58@21cn.com

謝鵬，Email：xiepeng58@21cn.com

1.重慶三峽醫藥高等專科學校基礎醫學部，萬州 404120；

2.重慶三峽中心醫院神經內科，萬州 404120；

R392

：A

：1002-2694(2017)09-0779-05

2017-02-14編輯：劉岱偉

國家重點基礎研究發展計劃(973 計劃，No.2009CB918300)

3.重慶醫科大學神經科學研究中心，重慶 400016

Supported by the National Basic Research Program of China (973 Program, Grant No. 2009CB918300)