沙門菌tcpS基因的血清型分布及其在特定血清型鑒定中的應用

熊 丹，宋 麗，陶 靜，鄭慧娟，周子皓，潘志明，焦新安

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2017.09.001

沙門菌tcpS基因的血清型分布及其在特定血清型鑒定中的應用

熊 丹，宋 麗，陶 靜，鄭慧娟，周子皓，潘志明，焦新安

目的建立基于tcpS基因的PCR鑒定方法，同時篩選腸炎沙門菌、雞白痢/傷寒沙門菌和都柏林沙門菌，為流行病學調查提供方便快速的實驗室技術支持，并為PCR鑒定沙門菌方法的發展提供新的基因候選。方法利用生物信息學的方法分析沙門菌tcpS基因的血清型分布特點，選擇27種不同血清型沙門菌以及10株非沙門菌菌株，對所建立PCR體系的特異性和靈敏性進行檢測，并將該方法應用于江蘇省分離的48株豬場分離株、22株雞場分離株和11株牛場分離株的檢測。結果生物信息學分析表明tcpS基因僅存在于腸炎沙門菌、雞白痢/傷寒沙門菌和都柏林沙門菌中，該PCR方法具有高度特異性和靈敏性，可準確快速地從臨床樣本中篩選這3種血清型沙門菌，且對實際樣本檢測符合率達100%。結論基于tcpS的PCR檢測方法可準確篩選腸炎沙門菌、雞白痢/傷寒沙門菌和都柏林沙門菌，能作為傳統血清學分型的輔助方法，為沙門菌PCR鑒定方法的發展提供了優良的基因候選。

沙門菌；tcpS基因；PCR；血清型

沙門菌病是公共衛生學上有重要意義的人獸共患病之一，其病原沙門菌屬于腸桿菌科，蛋、家畜和肉制品是主要傳播媒介，它不但可引起多種畜禽疾病，造成全身性敗血癥和腸炎，還可以作為食源性疾病的病原體，引起人類胃腸炎和食物中毒[1-2]。在我國細菌性食物中毒中，約有70%～80%是由沙門菌引起的[3]。

根據Kauffman-White血清型分型方法，依據沙門菌菌體抗原及鞭毛抗原的不同，沙門菌目前的血清型有2 600種以上[4]，中國已報道了292種不同的血清型，分屬于35個O群[5]。大多數的動物感染是由幾種主要的血清型沙門菌引起的，其中含有腸炎沙門菌、雞白痢/傷寒沙門菌和都柏林沙門菌[6-8]。腸炎沙門菌是人感染食源性病原菌的主要致病菌，并且是農產品和感染動物中最主要的沙門菌血清型[9]。雞白痢/傷寒沙門菌能特異性地感染家禽，可分別引起白痢和禽傷寒，且雞傷寒垂直傳播所帶來的危害已引起廣泛的重視[10]。都柏林沙門菌可增加奶牛的流產、發病率和致死率，并且降低牛奶的產量，引起奶牛業的重大經濟損失，已引起世界范圍內的高度關注[11-12]。因此，快速檢測這三種重要的血清型沙門菌顯得尤為重要。

傳統的檢測方法即非選擇性和選擇性增菌、生化特性及血清學鑒定，傳統方法費力耗時，需4～7 d才能完成，其它如抗體檢測法，雖然快速，但其高假陽性使之不適于常規檢測。此外，低水平的病原菌污染，食品加工后導致沙門菌的“致傷”及食品其它成分的干擾等因素，使得沙門菌的檢測受到一些限制。因此，急需一些快速、特異、靈敏的檢測方法，以及時發現致病菌，控制污染及其可能對人體健康產生的危害[13]。分子生物學技術的發展使得許多食品微生物學者尋求方便的方法如PCR技術來檢測病原菌，以期增加敏感性同時減少檢測時間。

聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction, PCR)是一種體外核酸擴增技術，具有敏感性強、特異性高、快速、簡便等優點，在醫學、生物學等領域中得到了廣泛應用。由于該方法快速、特異、敏感等優點，使之在沙門菌的檢測中已得到廣泛的應用[14]。PCR方法尤其適用于大樣本沙門菌的血清型快速判斷，可大大縮短檢測時間。如果樣本不屬于特定血清型沙門菌，也可根據PCR結果，選擇性的使用多價抗血清進行進一步判斷，可節約血清分型的時間以及血清的使用[15]。

沙門菌tcpS基因全長882 bp，目前關于其功能還未有研究報道，NCBI數據庫注釋其為一種假定蛋白，結構預測表明其4-36位氨基酸能夠形成coiled-coil結構域。本研究通過生物信息學方法首次發現tcpS基因僅存在于腸炎、雞白痢/傷寒和都柏林這3種血清型沙門菌中，以特異性引物通過PCR技術驗證了tcpS基因在不同血清型沙門菌及其它細菌中的分布。該PCR體系能快速準確鑒定腸炎、雞白痢/傷寒和都柏林血清型沙門菌，可作為沙門菌傳統血清學分型的輔助方法，并為這3種特定血清型沙門菌的監測與實驗室診斷提供了一種簡單快速、重復性好的新方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 評價PCR方法特異性和靈敏性的沙門菌和非沙門菌菌株信息見表1。

1.1.2 主要試劑 沙門菌診斷血清購自寧波天潤生物藥業有限公司，Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DL2000 DNA Marker購自大連寶生物工程有限公司，瓊脂糖購自西班牙Biowest公司。

1.1.3 主要儀器 PCR擴增儀、電泳儀TY2795、凝膠成像系統GelDoc XR+購自Bio-RAD公司，離心機、biophotometer分光光度計購自德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析tcpS基因的血清型分布 在NCBI中使用Blastn在線比對軟件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在全基因組數據庫中搜索tcpS基因序列(GenBank accession number KM408432)，初步分析tcpS基因的血清型分布特點。

表1 評價建立的PCR方法特異性和靈敏性的沙門菌和非沙門菌菌株
Tab. 1 Salmonella and non-Salmonella strains used to evaluate the specificity and sensitivity of the developed PCR method

StrainSerovar/speciesSourcePCRresult(882bp)SalmonellaC50041EnteritidisLaboratorystock+C50336EnteritidisLaboratorystock+S06004PullorumLaboratorystock+6508PullorumIsolatefromchicken+SG9GallinarumGiftfromBarrow[16]+SL5928DublinLaboratorystock+T3UgandaLaboratorystock-T9MeleagridisLaboratorystock-T8AnatisLaboratorystock-G2LondonLaboratorystock-ZXRissenLaboratorystock-Y7DerbyLaboratorystock-Y8TyphimuriumLaboratorystock-C500CholeraesuisLaboratorystock-ZH65IndianaLaboratorystock-ZH5SinstorfLaboratorystock-ZH10NewlandsIsolatefromcattle-ZH24MuensterLaboratorystock-ZH82YorubaIsolatefrompig-G449DumfriesLaboratorystock-G241KentuckyLaboratorystock-G382AgonaLaboratorystock-ZH35ThompsonLaboratorystock-P192SenftenbergLaboratorystock-G439BlockleyLaboratorystock-G86InchparkLaboratorystock-P122VirchowLaboratorystock-P74FarstaLaboratorystock-G85DabouLaboratorystock-Non-SalmonellaH37RvMycobacteriumtuberculosisATCC27294-11168CampylobacterjejuniATCC700819-110CampylobacterjejuniIsolatefromchicken-S19BrucellaabortusLaboratorystock-EGDeListeriamonocytogenesATCCBAA-679-JS15ListeriamonocytogenesIsolatefromsheep-1314EscherichiacoliIsolatefromchicken-1352EscherichiacoliIsolatefromchicken-25922EscherichiacoliATCC25922-J53EscherichiacoliLaboratorystock-

1.2.2 引物設計與合成 以tcpS基因為模板，設計并分析引物，上游引物tcpS-F：ATGTCTATAAGCACCACAATG，下游引物tcpS-R：TCATTTCAATAATGATTCAAGC，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2.3 模板制備 取過夜培養的菌液，PBS洗3遍，采用煮沸法進行細菌DNA的提取，100°C，10 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液作為DNA模板，4 ℃備用。

1.2.4 PCR反應 PCR反應體系為(25 μL)：ddH2O 16.25 μL，dNTP 2 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，tcpS-F 1 μL，tcpS-R 1 μL，模板2 μL，rTaq酶0.25 μL。PCR程序為94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，59 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.5 特異性評價 用已建立的PCR方法分別對27種不同血清型的沙門菌和10株非沙門菌菌株進行檢測(表1)，驗證該方法的特異性。

1.2.6 靈敏性評價 將沙門菌C50041菌株的基因組和菌液分別倍比稀釋，用已建立的PCR方法分別對不同稀釋度進行檢測，以分析該方法的檢測靈敏性。

1.2.7 臨床樣本檢測 將所建立的PCR 方法應用于本實驗室在江蘇省某豬場、雞場和牛場分離的待檢沙門菌，與傳統血清型鑒定方法進行比較。

2 結 果

2.1 生物信息學鑒定tcpS基因的分布 Blastn結果表明tcpS基因僅存在于腸炎沙門菌、雞白痢/傷寒沙門菌和都柏林沙門菌中，且核苷酸序列相似性為100%，而沙門菌其它血清型和其它物種均沒有這個基因。

2.2 PCR檢測方法的特異性分析 PCR電泳結果表明僅在以腸炎、雞白痢/傷寒和都柏林沙門菌基因組為模板的泳道中有目的條帶(圖1)，膠回收后測序結果表明所有的tcpS基因的核苷酸序列相似性均為100%。

2.3 PCR檢測方法的靈敏性分析 以不同濃度的腸炎沙門菌C50041基因組和菌液為模板分別進行PCR檢測，電泳結果顯示該PCR方法可最低檢測到4.35 pg/μL的基因組DNA和10 CFU的沙門菌(圖2)。

圖1 PCR方法檢測腸炎、雞白痢/傷寒和都柏林沙門菌的特異性分析Fig.1 Specificity of the PCR method for detection of Salmonella serovars Enteritidis, Pullorum/Gallinarum, and Dublin

圖2 PCR方法檢測腸炎沙門菌C50041基因組DNA(A)和細菌數(B)的靈敏性分析Fig. 2 Sensitivity of the PCR method for detection of genomic DNA (A) and cells (B) from S. Enteritidis (strain C50041)

2.4 PCR檢測臨床樣本 用建立的PCR方法對江蘇省某豬場(48株)、雞場(22株)和牛場(11株)分離的沙門菌進行檢測，以驗證所建立方法的準確性。PCR結果顯示，48株豬場分離的沙門菌、22株雞場分離的沙門菌和11株牛場分離的沙門菌完全符合其相應的傳統血清學分型結果(表2)。

3 討 論

血清型鑒定作為沙門菌分型的分類方法已有80多年歷史，至今仍然是國際微生物檢測機構認定的進行微生物學初篩的標準方法，對病原微生物研究的首要步驟也是血清學鑒定[17]。

表2 臨床樣本中傳統血清學分型方法與建立的基于tcpS的PCR方法的比較
Tab. 2 Comparison between traditional serotyping method and the developed tcpS-based PCR method on clinical Salmonella isolates

SourceSalmonellaserovarsTraditionalserotypingO:H1:H2IsolatenumberNo.ofstrainspositivefortcpSPigfarmEnteritidis9,12:g,m1212Derby4,12:f,g30Typhimurium4,12:i:2120Rissen6,7:f,g70Indiana4,12:z:1,730Chester4,12:e,h:x40London3:l,v:1,670ChickenfarmPullorum9,12:-:-1010Enteritidis9,12:g,m22Indiana4,12:z:770Thompson6,7:k:1,530CattlefarmDublin9,12:g,p11Newlands3:e,h:e,n,x80Muenster3:e,h:1,520

沙門菌可分為2 000多種血清型，鑒定時需質量保證且種類齊全的上百種血清，同時，也要求具備一定的經驗及準確判斷能力的實驗者。傳統血清型鑒定需購買特定的沙門菌血清型鑒定試劑盒，價格昂貴，步驟繁瑣，有效期短，包含的血清型也不齊全，且貨源緊缺，尤其在大樣本中分離特定的血清型沙門菌(如腸炎沙門菌、雞白痢/傷寒沙門菌或者都柏林沙門菌)時，需耗費數天時間，且工作量龐大，其結果是由肉眼進行判斷，因而可能存在人為誤差。目前，一些基于DNA和抗原的檢測方法已經應用在沙門菌的檢測上，如PCR和ELISA[18-19]。本文建立的基于tcpS基因的PCR檢測方法操作簡單，成本非常低，在3 h內即可完成對這3種血清型沙門菌的篩選，且準確率達到100%。

本研究所建立的PCR方法作為傳統血清學方法的一種補充，可用于大樣本中腸炎沙門菌、雞白痢/傷寒沙門菌和都柏林沙門菌的快速判斷，可大大縮短檢測時間。如果樣本不屬于這3種血清型，也可根據PCR結果，選擇性的使用多價抗血清進行進一步判斷，可節約血清分型的時間以及血清的使用。本研究為PCR鑒定沙門菌方法的發展提供新的基因候選，然而，更多的血清型特異性基因仍需探索，這些基因和tcpS的聯合使用將有助于沙門菌血清型鑒定方法的進一步發展。

本研究首次發現tcpS基因僅存在于腸炎、雞白痢/傷寒和都柏林這3種血清型沙門菌中，以特異性引物通過PCR技術驗證了tcpS基因在不同沙門菌血清型及其它細菌中的分布。基于tcpS的PCR方法能快速高通量篩選腸炎、雞白痢/傷寒和都柏林血清型沙門菌，可作為沙門菌傳統血清學分型的輔助方法，并為這3種特定血清型沙門菌的監測與實驗室診斷提供了一種簡單快速、重復性好的新方法。

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SerotypedistributionofSalmonellatcpSgeneanditsapplicationinidentificationofspecificserovars

XIONG Dan, SONG Li, TAO Jing, ZHENG Hui-juan, ZHOU Zi-hao, PAN Zhi-ming, JIAO Xin-an

(JiangsuKeyLaboratoryofZoonosis,JiangsuCo-innovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses,JointInternationalResearchLaboratoryofAgricultureandAgri-productSafetyoftheMinistryofEducation,KeyLaboratoryofPreventionandControlofBiologicalHazardFactors(AnimalOrigin)forAgrifoodSafetyandQuality,MinistryofAgricultureofChina,Yangzhou225009,China)

AtcpS-based PCR method was established to simultaneously screenSalmonellaentericaserovars Enteritidis, Pullorum/Gallinarum, and Dublin. The developed PCR method provides laboratorial support as a convenient and rapid approach for epidemiological investigation, andtcpScan be a potential candidate gene for the development of PCR-basedSalmonellaidentification. The serotype distribution ofSalmonellatcpSgene was analyzed by bioinformatic approach. The specificity and sensitivity of the PCR method were determined based on 27 differentSalmonellaserovars and 10 non-Salmonellastrains. The PCR method was applied to clinicalSalmonellaisolates from one pig farm (48 isolates), one chicken farm (22 isolates) and one cattle farm (11 isolates) from Jiangsu Province.Insilicoanalysis showed thattcpSexisted only inSalmonellaEnteritidis, Pullorum/Gallinarum, and Dublin. The developed PCR method had potent specificity and sensitivity, and could screen the three specificSalmonellaserovars accurately. The coincidence rate of the clinical sample detection was up to 100%. ThetcpS-based PCR detection method could screenSalmonellaEnteritidis, Pullorum/Gallinarum, and Dublin accurately, and could be an assistant method to the traditional serotyping method. Furthermore, the noveltcpSgene can be a potent gene candidate for the development of PCR method for the identification ofSalmonellaserovars.

Salmonella;tcpSgene; PCR; serotype

Pan Zhi-ming, Email: zmpan@yzu.edu.cn

國家重點研發計劃課題(2016YFD0501607)；公益性行業(農業)科研專項(201403054)；國家自然科學基金(31320103907, 31230070)；江蘇省重點研發項目(BE2015343)；江蘇省第9批“六大人才高峰”高層次人才項目(NY-028)；揚州大學科技創新團隊；江蘇省高校優勢學科建設工程項目聯合資助

潘志明，Email: zmpan@yzu.edu.cn

江蘇省人獸共患病學重點實驗室/江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心/農業與農產品安全國際合作聯合實驗室/農業部農產品質量安全生物性危害因子(動物源)控制重點實驗室，揚州 225009

R378.2

：A

：1002-2694(2017)09-0757-06

2017-03-29編輯：劉岱偉

Funded by the National Key Research and Development Program Special Project (No. 2016YFD0501607), the Special Fund for Agroscientific Research in the Public Interest (No. 201403054), the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31320103907 and 31230070), the Research and Development Program of Jiangsu (No. BE2015343), the “Six Talent Peaks Program” of Jiangsu Province (No. NY-028), the Yangzhou University Science and Technology Innovation Team, and the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD)