2011-2014年福建省手足口病相關病原柯薩奇病毒A組4型的分子流行病學分析

陳 煒，翁育偉，何文祥，朱 穎，黃 萌，張擁軍，謝劍鋒，鄭奎城，嚴延生

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2017.09.003

2011-2014年福建省手足口病相關病原柯薩奇病毒A組4型的分子流行病學分析

陳 煒，翁育偉，何文祥，朱 穎，黃 萌，張擁軍，謝劍鋒，鄭奎城，嚴延生

目的分析福建省手足口病患者中柯薩奇病毒A組4型(Coxsackievirus A4, CVA4)的流行病學、基因變異及遺傳進化等特征。方法應用細胞培養方法獲得病毒分離株，RT-PCR方法進行分子分型及擴增CVA4血清型完整VP1區全長序列，并進行序列變異及遺傳進化分析。結果2011-2014年，從福建省手足口病其它腸道病毒病例標本中分子分型33例CVA4病例，在407例的其它腸道病毒病例中的構成比為8.1%，其中2012年31例，2014年2例。CVA4病例在性別、年齡組分布特征，與一般手足口病流行特征相比，沒有特異性。VP1區序列差異比較表明，2011-2014年福建省CVA4分離株之間VP1核苷酸及氨基酸序列相似性分別在92.6%～100%、95.7%～100%；與原型株及國外地方株的核苷酸序列相似性較低，分別為 83.7%～85.4%、82.1%～89.1%，氨基酸序列相似性分別為96.1%～99.0%、90.4%～99.6%；與國內地方株核苷酸及氨基酸序列相似性較高，分別為87.9%～99.2%、96.1%～100%。進化樹結果表明福建CVA4分離株與原型株及國外代表株的遺傳距離遠，與國內代表株的遺傳距離近。福建CVA4分離株在進化樹的分布呈多個分支。結論CVA4已成為近年來福建省除EV71、CVA16、CVA6、CVA10外導致手足口病的又一重要病原體。福建CVA4分離株與國內地方株同進化共循環，在福建省各個地區同時流行多條親緣關系接近的傳播鏈。

手足口病；柯薩奇病毒A4；分子流行病學

手足口病(Hand, foot and mouth disease, HFMD)是由多種型別腸道病毒感染引起的5歲以下患兒常見傳染病，除腸道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)及柯薩奇病毒16型(Coxsackievirus A 16,CVA16)作為主要病原體外，其它腸道病毒在病原譜構成中也占有部分比例[1-4]。

2008年5月份，手足口病被列入我國丙類法定傳染病進行疫情網絡直報。福建省手足口病疫情網絡直報系統顯示，2008-2010年，EV71與CVA16的感染是福建省手足口病的主要病原體，而最近幾年其它腸道病毒在病原譜中的構成比例上升顯著。但是目前國家手足口病監測方案要求在開展手足口病病原學檢測項目中，只對總腸道病毒、EV71和CVA16進行檢測，未進一步分型鑒定其它腸道病毒。本研究在對福建省2011-2014年手足口病其它腸道病毒專項分型鑒定研究中，發現33例柯薩奇病毒A4(CVA4)感染病例，次于柯薩奇病毒A6(CVA6)柯薩奇病毒A10(CVA10)。本文對福建省2011-2014年手足口病相關病原CVA4開展流行病學、基因變異及遺傳進化等分子流行病學特征進行調查研究。

1 材料與方法

1.1 標本 來源于2011-2014年福建省福州、泉州、漳州、寧德、龍巖、南平等地區按照福建省手足口病監測實施方案要求上送至福建省疾病預防控制中心的其它腸道病毒手足口病標本(咽拭子、糞便等)，合計1 525例其它腸道病毒手足口病病例(2011-2014年分別為268例、622例、450例、182例)。

1.2 病毒分離培養 按照《手足口病實驗室手冊》[5]方法和標準對標本分別用人橫紋肌肉瘤細胞(Human Rhabdomyosarcoma, RD)和人喉癌上皮細胞(Human Laryngeal Carcinoma，HEp-2進行兩代分離培養，收獲細胞培養上清。RD細胞和HEp-2細胞均由中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所脊髓灰質炎實驗室提供。

1.3 RNA提取 使用QIAamp viral RNA mini kit(QIAGEN, Germany)試劑盒提取病毒的RNA，從140 μL的細胞培養上清中獲得50 μL的總RNA溶液，提取的RNA保存在-20 ℃待用。

1.4 分子分型 上述RNA樣本采用One step RT-PCR Kit(QIAGEN, Germany)試劑盒和應用腸道病毒通用引物PE1/PE2[5]進行進行腸道病毒篩查。一步法RT-PCR反應體系配置參照試劑盒說明書。擴增反應程序與關于CVA6、CVA10的報道[8-9]一致。得到的RT-PCR產物取5μL經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后觀察。

腸道病毒篩查陽性的病例標本采用Access one step RT-PCR Kit (Promega, USA)試劑盒和應用292/222引物[6]進行一步法RT-PCR反應，反應體系參照試劑盒說明書。擴增反應程序與關于CVA6、CVA10報道[8-9]一致。取5 μL RT-PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后觀察，陽性產物經膠回收純化測序，得到的序列應用http://www.rivm.nl/mpf/enterovirus/typingtool網站進行病毒血清型別的分型確定。

1.5 完整VP1區基因序列的獲取 血清型別為CVA4的病例標本使用One step RT-PCR Kit(QIAGEN, Germany)試劑盒和應用引物486/488, 487/489[7]分段擴增整個VP1區基因。擴增反應程序參照關于CVA6、CVA10的報道[8-9]。取5 μL RT-PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后觀察，陽性產物經膠回收純化測序。

1.6 生物信息學分析 采用DNASTAR軟件對CVA4型病毒進行核苷酸與氨基酸序列分析及同源性比較，構建系統發生樹采用Mega 6.0軟件的鄰接法(Neighbor-Joining)方式。

2 結 果

2.1 一般情況 共收集了福建省2011-2014年1 525例病例的其它腸道病毒標本(絕大部分為咽拭子，極少數為肛拭子)，上述標本分別經過兩種細胞(RD/Hep-2細胞)兩代次的細胞分離培養及分子分型鑒定，共獲得407例其它腸道病毒病例毒株，其中33例鑒定為柯薩奇病毒A4(CVA4)，為8.1%，次于柯薩奇病毒A6(CVA6)，為48.9%(199例)和柯薩奇病毒A10(CVA10)，為25.3%(103例)。

2.2 CVA4流行病學特征

2.2.1 時間分布 2011-2014年33例CVA4病例主要分布在2012年(31例)和2014年(2例)，2011年及2013年未檢測到CVA4病例。2012年的31例CVA4病例分別分布在4月份(6例)、5月份(12例)、6月份(8例)、8月份(2例)、9月份(3例)

2.2.2 地區分布 2012年的31例 CVA4病例分別分布在寧德(16例)，漳州(7例)，南平(6例)，福州(2例)；2014年2例分別分布在福州和南平地區。

2.2.3 人群分布

2.2.3.1 性別分布分析，33例的CVA4手足口病病例中，21例男性患者，12例女性患者，男女性別比為1.75∶1，而2008-2014年福建省手足口病總體疫情中的男女病例性別比約為1.7∶1(342 708 /202 172)，兩者之間沒有統計學差異(χ2=0.01,P=0.93>0.05)。

2.2.3.2 年齡組分布 根據0歲組、1歲組、2歲組、3歲組、4歲組、5歲組及以上6個年齡組進行分組，2011-2014年福建省33例CVA4手足口病病例的年齡組分布與手足口病總體病例的年齡組分布相似，主要分布于4歲組及以下年齡的幼兒，占97.0%(32/33)，而福建省2008-2014年手足病總體病例中4歲組及以下患兒的構成比為94.3%(514 000/544 880)，兩者之間沒有統計學差異(χ2=0.08,P=0.78>0.05)。

2.2.4 病例類型分布 按照疾病嚴重程度分類，2011-2014年福建省33例CVA4手足口病病例中，30例普通病例，3例重癥病例，無死亡病例。CVA4感染導致重癥和死亡的頻率為9.1%(3/33)，而2008-2014年福建省手足口病實驗室監測數據得到的EV71感染導致重癥和死亡的頻率為16.3%(1 376/8 449)，兩者之間無統計學差異(χ2=1.25,P=0.26>0.05)；與CVA16感染導致重癥和死亡的頻率(3.2%，115/3 630)相比，也無統計學差異(χ2=2.03,P=0.16>0.05)。

2.3 VP1區核苷酸及編碼氨基酸序列分析 對2011-2014年福建省33株CVA4病毒株分兩段RT-PCR擴增完整VP1區后測序拼接，得到24株CVA4毒株(其中2012年22株，2014年2株)的完整VP1區核苷酸序列，長度為915個堿基，與原型株(CVA4-High Point)相比，未發現核苷酸的缺失和插入。

2011-2014年福建省的24株CVA4分離株之間的VP1核苷酸序列相似性在92.6%～100%之間，氨基酸序列相似性在95.7%～100%之間。與原型株(CVA4-High Point)的核苷酸序列相似性在83.7%～85.4%之間，氨基酸序列相似性在96.1%～99.0%之間。與1999-2014年國外美國、俄羅斯、印度、日本、肯尼亞等地方分離株的VP1核苷酸序列相似性在82.1%～89.1%之間，氨基酸序列相似性在90.4%～99.6%之間。與1998-2014年的國內吉林、山東、安徽、寧夏、重慶、湖南、上海、廣東、云南等地方分離株的VP1核苷酸序列相似性在87.9%～99.2%之間，氨基酸序列相似性在96.1%～100%之間。

將VP1完整編碼區翻譯成氨基酸序列進行分析，發現2011-2014年福建省的24株CVA4分離株氨基酸序列的第18、34、44、200、281和304位置，是氨基酸變異的頻繁區域，詳見圖1。

圖1 福建省CVA4病毒分離株VP1區氨基酸序列差異Fig.1 Amino acid sequence differences in VP1 regions of Fujian CVA4 viruses

2.4 遺傳進化分析 采用Mega 6.0軟件，以鄰接法(Neighbor-Joining)方式，選取CVA16原型株為外群，基于VP1區基因，將福建省2011-2014年24株CVA4地方分離株與從GenBank檢索的50株國內外CVA4型代表株構建CVA4種系進化樹(圖2)。遺傳進化分析顯示，福建省2011-2014年24株CVA4地方分離株及從GenBank下載的50株國內外CVA4型病毒代表株，可以劃分成6個進化分支(A～F)，F分支又分為F1～F2兩亞分支。CVA4原型株(CVA4-High Point)及1999年肯尼亞株(Kenya11023.1/1999)分別獨自組成A分支與B分支；1999-2002年的美國株、2007-2009年印度株及2013年俄羅斯株組成C分支； 2002年、2004年日本地方株及2014年俄羅斯株組成D分支；中國CVA4地方分離株集中分布于E分支及F分支，E分支則由1998年的山東地方株及2006年的吉林地方株組成，而2006年之后的國內地方株，如吉林、山東、安徽、寧夏、重慶、湖南、上海、廣東、云南等地方分離株包括2011-2014年的24株CVA4福建分離株共同組成F分支；5株2012年福建分離株(2012FJND180、2012FJND303、2012FJFZ052、2012FJZZ128、2012FJZZ147)與一株2012年重慶地方株組成F1亞分支，其余17株2012年福建分離株及兩株2014年福建分離株與多數2006年之后的國內地方株形成F2亞分支。另外，從進化樹顯示，2011-2014年24株CVA4福建分離株與原型株(CVA4-High Point)及1999-2014年國外(美國、俄羅斯、印度、日本、肯尼亞等)分離株的遺傳距離較遠，親緣關系遠，與2006-2014年國內地區(如吉林、山東、安徽、寧夏、重慶、湖南、上海、廣東、云南等)分離株的遺傳距離近，親緣關系近。24株CVA4福建分離株相互之間的遺傳距離較近，親緣關系近。另外，種系進化樹顯示，2011-2014年福建省的24株CVA4分離株中，不同地區的CVA4分離株在某個亞分支或某一簇沒有明顯的集中分布，而是分散分布。

● 2012 Fujian isolates; ▲ 2014 Fujian isolates圖2 福建省CVA4病毒分離株VP1區基因序列種系進化樹Fig.2 Phylogenetic tree in VP1 regions of Fujian CVA4 viruses

3 討 論

本研究對福建省2011-2014年共計1 525例其它腸道病毒手足口病病例的標本開展病毒分離培養后分子分型檢測，共確定407例其它腸道病毒病例，其中柯薩奇病毒A4(CVA4) 的病例為33例，構成比為8.1%，位居第三位。構成比前兩位分別為：柯薩奇病毒A6(CVA6)48.9%(199例)和柯薩奇病毒A10(CVA10)25.3%(103例)，關于CVA6及CVA10已做相應的研究報道[8-9]。

福建省2011-2014年33例CVA4手足口病病例的三間分布及病例類型分布等流行病學數據進行分析表明，2008-2010年福建省手足口病病原譜以EV71和CVA16為主，從2011年開始福建省手足口病病原譜發生明顯變化，EV71及CVA16的構成比降低，CVA6、CVA10、CVA4等其它腸道病毒在病原譜的構成比上升，與EV71及CVA16共同成為近些年手足病流行的主要型別。CVA4的時間分布分析顯示，雖然CVA4在2011-2014年福建省總體手足口病病原普構成比不及CVA6及CVA10，位居第三位，但在某些年份，CVA4在手足口病病原普的構成比也相對較高，如2012年CVA4構成比與CVA10相當。地區分布分析顯示，雖然2011-2014年福建省各個地區手足口病病原譜變遷情況較為類似，手足口病新增加的主要病原型別為CVA6、CVA10，但某些年份部分地區，CVA4也成為手足口病主要病原，如2012年寧德地區的CVA4構成比甚至超過CVA6、CVA10，2012年漳州地區CVA4的構成比與CVA10相當。同時，近些年國內外也有關于手足口病疫情相關病原CVA4的研究報道[10-15]。這些提示，CVA4已成為近年來國內外及福建省除EV71、CVA16、CVA6、CVA10外導致手足口病的又一重要病原體。人群分布比較結果顯示，CVA4在性別、年齡組的分布特征與總體手足口病病例的性別、年齡組分布特征類似，兩者之間沒有統計學差異。病例嚴重程度分布比較結果顯示， CVA4感染導致重癥和死亡的頻率為9.1%，處在EV71(16.3%)和CVA16(3.2%)的中間區域，與EV71和CVA16均無統計學差異，考慮是由于樣本量較少，尚不能反映其真實的水平，今后將持續加強監測以獲得更多的病例數據資料。

VP1編碼區是病毒中和抗體的決定因子，對于病毒的抗原性和病毒血清的遺傳多樣性具有重要意義。基于VP1區擴增測序分析，已成為腸道病毒分型鑒定的主要方法，對VP1全部或部分基因序列分析已廣泛應用于腸道病毒感染的分子流行病學研究[1-2,6]。本研究分別通過擴增部分VP1區基因及擴增完整VP1區基因，來分型鑒定我省其它腸道病毒及分析我省其它腸道病毒的分子流行病特征。

福建省2011-2014年24株CVA4地方分離株的VP1區核苷酸序列及氨基酸序列分析結果顯示，福建省的24株CVA4地方分離株與CVA4原型株(CVA4-High Point)在核苷酸序列及氨基酸序列均存在較大差異。遺傳進化分析結果顯示，福建省的24株CVA4地方分離株與原型株(CVA4-High Point)及1999-2014年國外地區分離株的遺傳距離較遠，親緣關系遠，與1998-2014年國內地區分離株的遺傳距離近，親緣關系近。因此，福建省2011-2014年24株CVA4地方分離株并不是獨立進化，而是與國內其它地區的CVA4地方分離株存在同進化共循環的關聯；此外，福建省2011-2014年24株CVA4地方分離株，集中分布于F1、F2亞分支，以及福建省不同地區的CVA4分離株在某個亞分支或某一簇沒有明顯的集中分布，而是分散分布，提示福建省及福建不同地區存在多條親緣關系接近的CVA4傳播鏈同時流行，F2亞分支則為近年來國內及福建省CVA4分離株的主要流行分支。此外，將24株福建省CVA4分離株的VP1完整編碼區翻譯成氨基酸序列后結合系統進化分析，我們發現，分布在F1非主要流行亞分支上的福建省5株分離株(2012FJND180、2012FJND303、2012FJFZ052、2012FJZZ128、2012FJZZ147)與分布在F2主要流行亞分支上的福建省其它19株分離株在VP1區氨基酸第18、34、44、200、281和304等位點存在不同程度的差異。特別是在第18個氨基酸位點，F1非主要流行亞分支上的福建省5株分離株的氨基酸均為K，而F2主要流行亞分支上的福建省其它19株分離株均為R；在第34個氨基酸位點，F1非主要流行亞分支上的福建省5株分離株的氨基酸均為A，而F2主要流行亞分支上的福建省其它19株分離株多數為T。這些氨基酸位點上的差異特別是在第18個氨基酸位點(R / K)是否與CVA4的傳播力強弱等方面有關有待進一步的深入研究。

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MolecularepidemiologyofHFMD-associatedpathogencoxsackievirusA4inFujianProvince,2011-2014

CHEN Wei, WENG Yu-wei, HE Wen-xiang, ZHU Ying, HUANG Meng, ZHANG Yong-jun, XIE Jian-feng, ZHENG Kui-cheng, YAN Yan-sheng

(FujianCenterforDiseaseControlandPrevention,Fuzhou350001,China)

To analyze the epidemiology, genetic variation and genetic evolution of coxsackievirus A4 (CVA4) in patients with hand, foot and mouth disease in Fujian, the virus isolates were molecular typed and amplified the whole VP1 region by RT-PCR, then the genetic variation and evolution were studied. The results showed that 33 CVA4 cases (8.1%) were confirmed from the 407 non-EV71 non-CVA16 HFMD cases in Fujian Province during 2011 and 2014, accounting for 31 cases in 2012 and 2 cases in 2014. Compared with common characteristics of the HFMD epidemic, no specificity in the distribution of CVA4 cases was found between gender and age groups. Sequence analysis of VP1 nucleotide sequences of Fujian CVA4 isolates showed that the nucleotide and amino acid sequences similarity were 92.6%-100% and 95.7%-100% respectively, low similarity with the prototype (83.7%-85.4%, 96.1%-99.0%) and abroad isolates (82.1%-89.1%, 90.4%-99.6%) both in nucleotide and amino acid sequences, high similarity with domestic isolates both in nucleotide and amino acid sequences, with the similarity of 87.9%-99.2% and 96.1%-100%. The results from phylogenetic tree showed that the genetic distance between Fujian CVA4 isolates and the prototype and abroad strains was far, and the genetic distance was close to domestic isolates in China. The distribution of the phylogenetic trees of Fujian CVA4 strains showed multiple branches. Therefore, CVA4 is the major HFMD associated-pathogen other than EV71, CVA16, CVA6, and CVA10 in Fujian Province from 2011 to 2014. CVA4 strains from Fujian Province is co-circulating and co-evolving with other domestic isolates. There is existence of multiple closely related CVA4 transmission chains in various regions of Fujian.

hand, foot and mouth disease (HFMD); coxsackievirus A4 (CVA4); molecular epidemiology

Yan Yan-sheng, Email: yysh@fjcdc.com.cn

福建省自然科學基金(No.2016J01350)與福建省衛計委青年科研課題(No.2014-1-25)聯合資助

嚴延生，Email：yysh @fjcdc. com. cn

福建省疾病預防控制中心，福州 350001

R373.2

：A

：1002-2694(2017)09-0768-06

2017-02-08編輯：梁小潔

Support by the Provincial Natural Science Foundation of Fujian (No. 2016J01350) and the Youth Scientific Research Program of Fujian Provincial Health and Family Planning Commission (No. 2014-1-25)