UGT1A1和CYP2E1基因多態性與一線抗結核藥物所致肝損傷易感性研究

孫勤 劉輊彬 沙巍 肖和平

·論著·

UGT1A1和CYP2E1基因多態性與一線抗結核藥物所致肝損傷易感性研究

孫勤 劉輊彬 沙巍 肖和平

目的探討Ⅰ相藥物代謝酶的細胞色素P450 2E1(CYP2E1)和Ⅱ相藥物代謝酶的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A1(UGT1A1)基因多態性與抗結核藥物所致肝損傷(ATDILI)易感性的相關性。方法收集2012年3月至2015年12月期間在上海市肺科醫院住院的經一線抗結核藥物治療后發生肝損傷的患者461例(為ATDILI組)，與同期住院未發生肝損傷的患者466例(為非ATDILI組)；對兩組患者的臨床信息進行統計分析，同時采集兩組患者的外周靜脈血進行基因組DNA提取和基因分析；采用生物信息統計學方法篩選出與CYP2E1和UGT1A1基因14個標簽單核苷酸多態性位點(tagSNP；Hardy-Weinberg平衡P值>0.001，最小等位基因頻率>0.1，r2>0.8)，應用SNPscanTM多重SNP分型技術對研究對象DNA樣本進行基因分型，分析這些位點基因型和單倍型在ATDILI組和非ATDILI組之間的頻率及分布差異，分析在顯性、隱性和加性遺傳模型下各個SNP位點與ATDILI易感性的關聯性。結果所有位點的等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡。ATDILI組UGT1A1基因rs4148323位點AA基因型頻率(1.7%，8/461)明顯低于非ATDILI組(4.3%，20/466)，顯示攜帶rs4148323位點AA基因型可降低ATDILI患病的風險(OR=0.37，95%CI=0.16～0.86，P=0.020)；在隱形遺傳模型下，攜帶該位點AA基因型可明顯降低ATDILI患病的風險(OR=0.39，95%CI=0.17～0.90，P=0.023)；在加性遺傳模型下，攜帶該位點突變型A等位基因可明顯降低ATDILI患病風險(OR=0.79，95%CI=0.63～0.99，P=0.040)。單倍型分析顯示：ATDILI組UGT1A1基因ATG單倍型頻率(0.19)明顯低于非ATDILI組(0.22)，說明攜帶ATG單倍型可明顯降低ATDILI患病的風險(OR=0.79，95%CI=0.63～0.99，P=0.045)。未發現其他位點與ATDILI的相關性。結論UGT1A1基因為中國漢族人群ATDILI的易感基因。

結核； 藥物性肝損傷； 多態性，單核苷酸； 疾病遺傳易感性

化療對結核病的防治尤為重要，但抗結核藥物在治療疾病的同時會造成部分患者發生不良反應，如抗結核藥物所致肝損傷(anti-TB drug induced liver injury，ATDILI)。筆者前期隊列研究發現，ATDILI在使用一線抗結核藥物的住院患者中發生率約為12.9%，可導致患者痰菌陰轉率和肺內空洞閉合率下降，治療失敗率明顯提高[1]。造成ATDILI的原因是多方面的，隨著分子生物學的發展，越來越多證據表明：遺傳因素是造成藥物不良反應個體間或群體間差異明顯的決定性因素。參與抗結核藥物在體內代謝的藥物轉運體、藥物代謝酶等的遺傳多態性可引起相關底物功能發生改變，從而影響藥物在體內的吸收、分布等代謝過程和中間代謝產物[2-5]。同其他藥物一樣，抗結核藥物在體內的代謝主要經歷2個時相：Ⅰ相代謝和Ⅱ相代謝。本研究選擇Ⅰ相藥物代謝酶的細胞色素P450 2E1(cytochrome P 450 2E1，CYP2E1)和Ⅱ相藥物代謝酶的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A1(UDP-glucuronosyltransferase1 A1，UGT1A1)基因作為候選基因，采用生物信息統計學篩選出目標基因的全部標簽單核苷酸多態性位點(tagSNP)，通過大樣本的病例-對照研究UGT1A1和CYP2E1基因是否是中國漢族人群ATDILI的易感基因。

資料和方法

1.研究對象：收集2012年3月至2015年12月期間在上海市肺科醫院住院的經一線抗結核藥物治療后發生肝損傷的患者461例(為ATDILI組)，與同期住院未發生肝損傷的患者466例(為非ATDILI組)。ATDILI組中，男283例，女178例；平均年齡(38.2±13.7)歲，體質量指數(BMI)為22.3±3.8；非ATDILI組中，男287例，女179例；平均年齡(38.9±13.5)歲，BMI為23.1±3.4。兩組比較：性別構成比、年齡和BMI均數的差異均無統計學意義(χ2=0.004，P=0.950；t=0.219，P=0.225；t=0.247，P=0.176)。本研究通過同濟大學醫學院和上海市肺科醫院的倫理審查，所有患者均經過知情同意。

2.納入排除標準：(1)納入標準：①均為上海市接受全程督導短程化學治療(DOTS)的結核病患者，年齡范圍16～65歲；②采用標準化初治化療方案，強化期為2～3個月的異煙肼(0.3 g/d)、利福平(0.45～0.6 g/d)、乙胺丁醇(0.75 g/d)和吡嗪酰胺(1.5 g/d)；③HIV感染陰性。(2)排除標準：①患有基礎性肝病(如各種病毒性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝病、酒精性肝病等)及抗結核治療前存在肝功能不全者；②一開始未采用標準化治療者(如乙型肝炎病毒DNA陽性的活動性肝炎，重癥結核性腦膜炎采用大劑量和4種以上抗結核藥物等)；③治療中途因非肝損傷原因更改化療方案者[如初次藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)提示耐藥、菌種鑒定為非結核分枝桿菌，以及因發生其他不良反應變更方案等]。

3.診斷標準：ATDILI診斷參照《抗結核藥所致藥物性肝損傷診斷與處理專家建議》[6]，概括如下：血清丙氨酸轉氨酶(ALT)>2倍正常值上限(ULN)或總膽紅素(TBIL)>2倍ULN；或天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)和TBIL同時升高，且至少1項>2倍ULN。

4.UGT1A1和CYP2E1基因tagSNP的篩選：采用HapMap數據庫載入UGT1A1和CYP2E1基因，每個基因上下游各擴展10 kb區域，將獲得的位點導入Haploview(version 4.1)，以下述標準進行位點質控：Hardy-Weinberg平衡(HWE)P值>0.001，最小等位基因頻率>0.1，r2>0.8。最后共獲得14個tagSNP，位點信息見表1。

5.基因組DNA提取和基因分型：采集受試者外周靜脈血2 ml保存至乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，采用Qiagen DNeasy全血DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)并按照標準操作說明進行基因組DNA提取。由上海天昊生物科技有限公司采用SNPscanTM多重SNP分型技術對所有DNA進行基因分型，連接反應、連接產物多重熒光PCR擴增、擴增產物熒光毛細管電泳分離均參考試劑盒說明書。PCR擴增產物用美國ABI公司 ABI3730XL測序儀進行毛細管電泳，測序儀上收集的原始數據用 GeneMapper 4.1(美國Applied Biosystems公司)分析。

結 果

1.UGT1A1和CYP2E1基因多態性與ATDILI易感性的相關性：UGT1A1和CYP2E1基因共14個tagSNP在461例ATDILI和466例非ATDILI患者中進行了基因分型，所有位點的等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡(表1)。結果顯示：攜帶UGT1A1基因rs4148323位點AA基因型可明顯降低ATDILI患病的風險(OR=0.37，95%CI=0.16～0.86，P=0.020)，見表2。同時，在隱形遺傳模型下，攜帶UGT1A1基因rs4148323位點AA基因型可明顯降低ATDILI患病的風險(OR=0.39，95%CI=0.17～0.90，P=0.023)；在加性遺傳模型下，攜帶UGT1A1基因rs4148323位點突變型A等位基因可明顯降低ATDILI患病風險(OR=0.79，95%CI=0.63～0.99，P=0.040)，未發現UGT1A1基因余下tagSNP與ATDILI患病易感性相關，本研究也未發現CYP2E1基因與ATDILI患病有相關性(表3)。

表1 CYP2E1和UGT1A1基因共14個tagSNP信息

注HWE：Hardy-Weinberg平衡檢驗；MAF：最小等位基因頻率

2.UGT1A1和CYP2E1基因單倍型與ATDILI易感性的相關性：采用Haploview 4.1軟件繪制UGT1A1基因4個位點和CYP2E1基因10個位點的LD分布圖，UGT1A1基因含有1個LD區，包括rs4148323、rs4148326、rs12479045等位點。CYP2E1基因分為2個LD區，LD區1由2個位點組成：rs10857736、rs3813867；LD區2由6個位點組成：rs915908、rs4646976、rs743535、rs2249695、rs1952467、rs4240522。根據LD分布圖確定相應的單倍型并分析單倍型頻率在兩組間的分布。結果顯示：攜帶UGT1A1基因ATG單倍型可明顯降低ATDILI患病風險(OR=0.79，95%CI=0.63～0.99，P=0.045)。未發現攜帶UGT1A1基因余下的單倍型與CYP2E1基因任一單倍型與ATDILI患病相關(表4)。

表2 CYP2E1和UGT1A1基因14個tagSNP在ATDILI組和非ATDILI組的基因型頻率分布比較

續表2

表3 CYP2E1和UGT1A1基因14個tagSNP在不同遺傳模型下與ATDILI易感性的相關性

續表3

表4 CYP2E1和UGT1A1基因單倍型頻率與ATDILI易感性的相關性

討 論

現有關于ATDILI易感基因的研究結論缺乏一致性，甚至在同一地區同一人種都得不到一致性的結果，原因在于研究設計存在一定的局限性：(1)所納入的樣本數尤其是病例組樣本例數非常少，往往只有數十例，而足夠大的樣本數量是基因SNP和表型相關研究的最關鍵因素之一，理論上講樣本量越大結論越可靠；(2)先前研究包含的SNP位點較少，往往是選擇單個或少數幾個SNP位點，無法覆蓋目標基因的大部分區域。本研究通過生物信息統計學方法篩選出UGT1A1和CYP2E1基因包括上下游各擴展10 kb區域內的全部tagSNP，采用較大樣本病例對照研究在927例中國漢族人群中進行基因分型，發現UGT1A1基因多態性與ATDILI易感性密切相關，但未發現CYP2E1基因與ATDILI相關。

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶(UGT)是生物體內最為重要的Ⅱ相藥物代謝酶，它主要催化內源性物質(如膽紅素、類固醇類)或外源化合物(如各種藥物、酚類)與輔因子尿苷二磷酸葡萄糖醛酸結合，增加親脂性底物的極性，促進其從尿液或膽汁排出。因此，葡萄糖醛酸化反應可以降低化合物的活性或者毒性，同時加速化合物的清除，在肝臟代謝解毒方面發揮著重要的作用[7-9]。UGT1A1是UGT基因超家族中的一員，位于染色體2q，UGT1A1酶主要分布于肝臟。關于UGT1A1基因多態性與ATDILI相關性的研究目前非常少見。有研究顯示：UGT1A1*27和UGT1A1*28與ATDILI易感性相關并可增加患者抗結核藥物治療后發生肝損傷的風險 (OR=13.859，95%CI=1.085～177.056，P<0.05)[8]，該研究中只有17例ATDILI患者，結果很可能存在偏倚。Chen等[9]則未發現UGT1A1基因與ATDILI易感性存在相關，該研究中病例組也只包含87例。本研究發現：攜帶UGT1A1基因rs4148323位點AA基因型明顯降低ATDILI患病的風險，攜帶其突變A等位基因在加性模型下明顯降低ATDILI患病風險。同時，單倍型分析顯示攜帶UGT1A1基因ATG單倍型可降低ATDILI患病風險。考慮攜帶突變A等位基因或ATG單倍型可能增加UGT1A1基因的表達從而增強UGT1A1酶的活性，通過葡萄糖醛酸化反應加速抗結核藥物毒性產物的清除，起到護肝臟的作用。

CYP450酶系是最為重要的Ⅰ相代謝酶，臨床上約60%～70%的藥物通過其代謝。CYP2E1是CYP450家族中的一員，肝臟是CYP2E1分布含量最高的器官，其基因CYP2E1位于染色體10q。關于CYP2E1基因多態性是否與ATDILI易感性相關，目前國內外研究結果還存在很大爭議。Singla等[5]報道，CYP2E1*5B的c1/c2雜合子基因型與ATDH易感性相關(OR=7.47，95%CI=1.263～34.32，P=0.04，n=17)；王濤等[10]研究結果指出，CYP2E1基因Rsa Ⅰ cl/c1野生基因型與ATDILI的發生相關(OR=1.979，95%CI=1.106～3.891，P=0.023，n=85)；也有研究未發現CYP2E1與ATDILI易感性相關[11-12]。本研究雖然驗證了CYP2E1基因及其上下游各10 kb區域的10個tagSNP在較大樣本(461例ATDILI組與466例非ATDILI組)中基因型頻率、單倍型頻率及分布的差異，但未發現任一位點與ATDILI易感性相關。

綜上所述，本研究發現UGT1A1基因為中國漢族人群ATDILI的易感基因，無論是基因型還是單倍型分析。這些發現進一步補充了ATDILI的分子遺傳機制，為臨床上通過檢測易感基因來預測ATDILI 患病提供了有力依據。下一步應研究UGT1A1基因rs4148323位點是否調控及如何調控基因的表達和蛋白質的功能、降低ATDILI患病的具體分子機制。

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(本文編輯：李敬文)

AssociationbetweenUGT1A1andCYP2E1genepolymorphismsandsusceptibilityoffirst-lineanti-tuberculousdruginducedliverinjury

SUNQin,LIUZhi-bin,SHAWei,XIAOHe-ping.

ClinicandResearchCenterofTuberculosis,ShanghaiKeyLaboratoryofTuberculosis,ShanghaiPulmonaryHospital,TongjiUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200433,China

Correspondingauthor：SHAWei,Email:shfksw@126.com

ObjectiveTo explore the association between a phase Ⅰ drug metabolizing enzyme encoding geneCytochromeP450 2E1 (CYP2E1) and a phase Ⅱ drug metabolizing enzyme encoding geneUDP-glucuronosyltransferase1 (UGT1A1) and susceptibility of first-line anti-tuberculous drug induced liver injury (ATDILI).MethodsFour hundred and sixty-one patients with ATDILI and 466 patients with non-ATDILI who were hospitalized in Shanghai Pulmonary Hospital from March 2012 to December 2015 were included in this study. The clinical characteristics of the two groups were compared. A whole blood sample was collected from each patient for genomic DNA extraction and genotype analysis. Fourteen tagSNPs ofUGT1A1 andCYP2E1 gene were selected using systematic bioinformatic analysis (Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE)-P>0.001, Minimum-allele Frequency >0.1,r2>0.8). We performed a population based case-control study to genotype the 14 tagSNPs ofUGT1A1 andCYP2E1 gene using SNPscanTMtechnology. The genotype and haplotype frequencies were detected and compared between the two groups. Three genetic models including dominant, recessive and additive model were used to analyze the association between all the selected SNPs polymorphisms and susceptibility of ATDILI.ResultsAll the alleles frequencies of these SNPs were in HWE. We found that in ATDILI group, the frequency ofUGT1A1 rs4148323 AA genotype (1.7%, 8/461) was significantly lower than that in non-ATDILI group (4.3%, 20/466), which indicated that thers4148323 A/A carriers had a decreased risk for developing ATDILI (OR=0.37, 95%CI=0.16-0.86,P=0.020). In recessive model, rs4148323 A/A was also associated with a decreased risk for ATDILI (OR=0.39, 95%CI=0.17-0.90,P=0.023). In additive model, allele of rs4148323 minor A was found to be associated with risk reduction with ATDILI (OR=0.79, 95%CI=0.63-0.99,P=0.040). Haplotype analysis showed the frequency of ATG haplotype ofUGT1A1 gene in ATDILI group (0.19) were significantly lower than that in non-ATDILI group (0.22), which demonstrated that ATG haplotype was related to the decreasing of ATDILI incidence (OR=0.79, 95%CI=0.63-0.99,P=0.045). We didn’t find any other SNP that was associated with ATDILI.ConclusionOur study showed thatUGT1A1 gene is a susceptibility gene of ATDILI in Chinese Han population.

Tuberculosis; Drug-induced liver injury; Polymorphism, single nucleotide; Genetic predisposition to disease

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.10.010

國家自然科學基金青年項目(81400006)；上海市浦江人才計劃(16PJD041)；國家科技重大專項(2014ZX09507008)

200433 同濟大學附屬上海市肺科醫院結核病臨床研究中心 上海市結核(肺)重點實驗室

沙巍，Email：shfksw@126.com

2017-03-02)