實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用

孫娜+張穎

利用基因工程技術(shù)對(duì)基因組的構(gòu)成進(jìn)行改變，將一些比較優(yōu)良的外源基因?qū)胫参铩?dòng)物或者微生物的體內(nèi)，使其遺傳物質(zhì)、性狀、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值或者品質(zhì)向人們所需要的目標(biāo)進(jìn)行改變，從而獲得產(chǎn)品或者以其為原材料進(jìn)行加工后得到的食品，稱(chēng)為轉(zhuǎn)基因食品。目前，我國(guó)在轉(zhuǎn)基因作物種植方面也加大了力度，轉(zhuǎn)基因作物的種植項(xiàng)目已經(jīng)增加至25個(gè)，但是轉(zhuǎn)基因食品在安全方面的問(wèn)題還沒(méi)有被人們所接受，因此，必須要加強(qiáng)對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行有效的標(biāo)識(shí)管理，嚴(yán)格控制外源基因的含量，但是這些都需要準(zhǔn)確有效的基因檢測(cè)技術(shù)。目前，在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)方面的檢測(cè)技術(shù)主要有兩方面，分別是對(duì)外源基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)和直接檢測(cè)外源基因，其中對(duì)外源基因序列的檢測(cè)是目前比較常見(jiàn)的檢測(cè)方式，主要的方法是PCR方法，這個(gè)方法是以核心作為基礎(chǔ)。隨著科學(xué)技術(shù)水平的不斷提高，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)也隨之出現(xiàn)，其結(jié)合PCR技術(shù)和探針雜交技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有很高的靈敏度，是傳統(tǒng)PCR技術(shù)的100倍左右，其檢測(cè)原理是通過(guò)探測(cè)PCR工程中熒光信號(hào)的變化情況來(lái)定量DNA模板量。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的涵義

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光集團(tuán)，利用熒光信號(hào)的變化來(lái)對(duì)整個(gè)PCR的反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)及時(shí)獲得特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的量，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)進(jìn)行定量的檢測(cè)方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可以對(duì)DNA模板進(jìn)行定量分析，具有靈敏度高、特異性和可靠性強(qiáng)、污染小、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的基本原理。在檢測(cè)過(guò)程中，隨著PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)增加，反應(yīng)過(guò)程所產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)也不斷增加指數(shù)方式增加，然后逐漸轉(zhuǎn)入平臺(tái)期，這個(gè)時(shí)候?qū)崟r(shí)熒光定量PCR就會(huì)對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，熒光信息的變化情況經(jīng)過(guò)電腦會(huì)自動(dòng)繪成一條曲線(xiàn)，然后根據(jù)曲線(xiàn)中的指數(shù)期內(nèi)的節(jié)點(diǎn)的PCR產(chǎn)物的量來(lái)判斷DNA模板的含量。

熒光閾值是以PCR 反應(yīng)前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光閾值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，一般要判斷熒光信號(hào)是否可信就要看測(cè)出的熒光信號(hào)是不是在熒光閾值以上，這樣可以定義一個(gè)樣本的Ct值，Ct指在PCR循環(huán)過(guò)程中，熒光信號(hào)開(kāi)始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，也就是每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線(xiàn)性關(guān)系， 起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

常用方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在化學(xué)原理上可以分為兩類(lèi)，分別是非探針類(lèi)和探針類(lèi)；其中探針類(lèi)是利用探針來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，常用的方法有TaqMan探針?lè)ǎ环翘结橆?lèi)是利用熒光染料來(lái)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的增加進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，常用的有SYBR GreenⅠ檢測(cè)法。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品領(lǐng)域中的應(yīng)用

定量分析策略。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中，模板定量方法主要有兩種，分別是相對(duì)定量和絕對(duì)定量。（1）相對(duì)定量。主要是指在一定的樣品中靶序列相對(duì)于另一參照序列的量的變化，相對(duì)定量又分為比較Ct值法和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法，主要是依據(jù)相對(duì)定量方法是否需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)區(qū)分的。比較Ct值法是不需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的，但是它的前提是以靶基因和內(nèi)源控制物的擴(kuò)增效率保持基本一致，效率的偏移將影響實(shí)際拷貝數(shù)的估計(jì)。這種方法計(jì)算出的相對(duì)定量結(jié)果通常比實(shí)際結(jié)果要高，誤差較大。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法首先要準(zhǔn)備好標(biāo)準(zhǔn)品，其中包括目的的基因和內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)品，然后根據(jù)設(shè)定的梯度進(jìn)行準(zhǔn)確的配比稀釋?zhuān)话闶且?/10的梯度倍比進(jìn)行稀釋?zhuān)缓笾瞥蓸?biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到目的基因和內(nèi)參基因的值，并將這兩個(gè)基因的比值作為定量的最后結(jié)果。這種方法所得出的結(jié)果根據(jù)某個(gè)參照物的量而言的，且這種方法制作起來(lái)比較簡(jiǎn)易，只需要知道標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋倍數(shù)就可以了。（2）絕對(duì)定量。主要是指已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)推算出未出的樣本的定量。在使用這個(gè)方法時(shí)首先要克隆目的基因和參照基因的擴(kuò)增片段，然后構(gòu)建體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄獲得已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，這種方法具有 穩(wěn)定、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。另外，如果要定量多種目的基因，就需要針對(duì)不同的目的基因制備不同的定量標(biāo)準(zhǔn)品，但是這樣會(huì)影響到定量的效率。

選擇目標(biāo)序列。在轉(zhuǎn)基因成本定量分析中通常選擇轉(zhuǎn)基因生物基因組中的外源序列作為目標(biāo)序列，其中包括有啟動(dòng)子、終止子、目的基因等。根據(jù)檢測(cè)的外源目標(biāo)序列的不同分類(lèi)，轉(zhuǎn)基因食品在應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)有四種序列的檢測(cè)，分別是通用序列檢測(cè)、結(jié)構(gòu)特異性序列檢測(cè)、基因特異性序列檢測(cè)和品系特異性序列檢測(cè)。

通用序列檢測(cè)包括有調(diào)控基礎(chǔ)序列和抗性標(biāo)記基因序列，最終檢測(cè)特定轉(zhuǎn)化的靶基因。例如針對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥品系中通用的ubiq-uitin啟動(dòng)子、NOS終止子以及標(biāo)記基因bar基因進(jìn)行定性篩選檢測(cè)，同時(shí)用已知為單拷貝的Wx012基因作為內(nèi)源特異參照基因，繪制內(nèi)源基因和外源基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，建立了轉(zhuǎn)基因小麥的RTQ-PCR 檢測(cè)方法。由于相同的通用元件和標(biāo)記基因被常用語(yǔ)多種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的研究和生產(chǎn)中，一般只能用于初步的篩選。

結(jié)構(gòu)特異性序列是指在插入載體的外源基因間的2個(gè)元件的連接區(qū)域序列，這種方法具有相對(duì)較高的特異性，因而被廣泛應(yīng)用與轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)中。但是在相同的轉(zhuǎn)基因外源表達(dá)載體在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，可能會(huì)出現(xiàn)1個(gè)或者2個(gè)或者對(duì)個(gè)拷貝的形式插入不同或者相同的植物基因組中，從而形成不同的轉(zhuǎn)基因品系，這些轉(zhuǎn)基因品系都具有相同的農(nóng)藝性狀，所以說(shuō)，這種方法在具有相同農(nóng)藝性狀的轉(zhuǎn)基因植物和不同培育品系兩者之間不能夠得到很好區(qū)分。

基因特異性序列主要是指插入的外源特異性基礎(chǔ)的內(nèi)部的一段序列，這段序列可以是天然來(lái)源的基因序列，也可以是人工改進(jìn)的序列。但是，由于相同的外源基因可能在相同或不同的植物中表達(dá)會(huì)形成新的具有相同農(nóng)藝性狀的品系或新的轉(zhuǎn)基因植物，因此基因特異性檢測(cè)方法在檢測(cè)具有相同農(nóng)藝性狀的轉(zhuǎn)基因植物及其品系時(shí)并不適用。

品系特異性序列是指插入的外源序列與植物基因組連接的邊界序列。這種檢測(cè)方法具有較高的特異性和準(zhǔn)確性，主要是因?yàn)槊恳粋€(gè)轉(zhuǎn)基因植物品系都具有特異的外源插入載體與植物基因組的連接區(qū)序列，且連接區(qū)序列是單拷貝。這種檢測(cè)方法目前在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)中的應(yīng)用研究是最受關(guān)注和重視的，大多數(shù)的商品化轉(zhuǎn)基因植物都建立了品系特異性檢測(cè)方法，如轉(zhuǎn)基因大豆品系（DP-305423-1[18]、GTS40-3-2[19]、DP-356043-5[20]）。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)領(lǐng)域中的問(wèn)題與展望

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用解決了轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)中對(duì)于靈敏、準(zhǔn)確和快速的要求，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)突破了傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)中智能重點(diǎn)檢測(cè)的局限，采用了全封閉管分析、利用電腦分析軟件對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和自動(dòng)定量，從而提高了檢測(cè)的靈敏度和精密度；實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在定量動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)高達(dá)5個(gè)數(shù)量級(jí)，并且得到的結(jié)果的重現(xiàn)性較好。由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中熒光探針針對(duì)靶序列設(shè)計(jì)，具有高特異性，可以快速進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。但是實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中也存在一些問(wèn)題，如：在檢測(cè)的過(guò)程中需要特殊的熱循環(huán)儀器和試劑，導(dǎo)致檢測(cè)的成本較高；同時(shí)在檢測(cè)過(guò)程中會(huì)受到很多因素的影響，可能會(huì)導(dǎo)致定量結(jié)果出現(xiàn)誤差較大的情況，如探針比例、同源和異源DNA背景、dNTP的濃度等。因此，針對(duì)這些問(wèn)題，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的操作過(guò)程中必須充分驗(yàn)證所設(shè)計(jì)引物的特異性和優(yōu)化反應(yīng)條件。隨著轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步，在提高實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的靈敏度和重復(fù)性方面有多種技術(shù)并取得了明顯的效果，從而使樣品的制備更加簡(jiǎn)單和程序化。

隨著我國(guó)基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中也得到了廣泛的應(yīng)用，越來(lái)越多的改良特征轉(zhuǎn)基因食品也隨之出現(xiàn)并得到迅猛的發(fā)展，但是轉(zhuǎn)基因食品的安全性還是目前我們所擔(dān)憂(yōu)的問(wèn)題。為了保證轉(zhuǎn)基因食品的安全性，制定了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)簽制度，建立快速、準(zhǔn)確、高通量的定量檢測(cè)方法顯得非常必要，是保證轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)簽制度順利實(shí)施的基礎(chǔ)，因而具備這些特點(diǎn)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用將會(huì)得到更大范圍的普及。

實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因食品實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)首要面臨的問(wèn)題是構(gòu)建相應(yīng)品系的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。在傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建過(guò)程中，主要是以轉(zhuǎn)基因材料與其對(duì)應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因材料按一定的質(zhì)量比例配制而成，從而獲得一系列質(zhì)量分?jǐn)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)品，再建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)對(duì)樣品進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)，這種方法具有一定的局限性，除了目前市場(chǎng)上常用的轉(zhuǎn)基因品系外，許多轉(zhuǎn)基因品系的標(biāo)準(zhǔn)樣品還難以得到。而隨著轉(zhuǎn)基因植物品系的日益增多，對(duì)于許多新增的轉(zhuǎn)基因品系的標(biāo)準(zhǔn)樣品的獲得將更加困難，那么對(duì)于這些品種的檢測(cè)就更加難以實(shí)現(xiàn)，使這些轉(zhuǎn)基因食品的安全得不到保障，同時(shí)也在很大程度上限制了轉(zhuǎn)基因生物研究和監(jiān)管工作的發(fā)展。

此外，雖然實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)上突破了從定性到定量的界限，實(shí)現(xiàn)了精確定量到絕對(duì)定量的轉(zhuǎn)變，但是隨著全球生物技術(shù)的發(fā)展，很多復(fù)合型轉(zhuǎn)基因植物也出現(xiàn)了，新的轉(zhuǎn)基因植物趨向于復(fù)合基因改造，如以8 個(gè)基因?yàn)榛A(chǔ)的Smartstax就是一種新型的復(fù)合性狀生物技術(shù)玉米產(chǎn)品，是迄今最先進(jìn)的獲批的生物技術(shù)作物。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因食品的生產(chǎn)工藝也在逐漸改善和優(yōu)化，食品加工過(guò)程原料中的轉(zhuǎn)基因序列遭到嚴(yán)重破壞。這些都對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)提出了更高的要求和標(biāo)準(zhǔn)。

綜上所述，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)領(lǐng)域的一種突破，可以更加快速、靈敏、準(zhǔn)確的對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行檢測(cè)，提高轉(zhuǎn)基因食品的安全性，在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)領(lǐng)域中具有良好的應(yīng)用和發(fā)展前景。