反相高效液相法分析羅漢果皂苷V

李飛妍++黃玲++萬紅麗

基本知識

（1）皂苷V的基本知識

皂苷是羅漢果中的一種非糖甜味成分，為極性較強的大分子化合物，不易結晶，易溶于水和醇，難溶于有機溶劑，具多種生物活性。

皂苷V（又稱甜苷V）易溶于水、甲醇、乙醇等極性溶劑，不溶于石油醚、氯仿等低極性有機溶劑。

（2）反相高效液相色譜法（RP-HPLC）的分離機理

RP-HPLC是高效液相色譜法中較常用的分離方法，其機理是采用流動相極性大于固定相的流動相來分離含極性官能團的有機化合物；分子在反相色譜柱中是按其極性的大小移動，極性越大被洗脫出越快；

選題意義及國內外發展狀況

近年，甜苷類化合物越來越吸引人們注意，而目前我國對羅漢果皂苷提取物的分離、純化以及含量測定的研究依然極少。

皂苷V是甜苷中的主要甜味成分，羅漢果甜苷類產品質量一般以羅漢果皂苷V的含量來評價。故對皂苷V提取和含量分析具重要的意義。

反相高效液相色譜法測定羅漢果中皂苷V的含量

實驗用品。

（1）材料

羅漢果干果；羅漢果甜苷V標準品來源：中國藥品生物制品鑒定所；純度（R）：100%

（2）主要試劑

乙睛（色譜純）、蒸餾水、甲醇（分析純）、乙醇（分析級）

（3）使用儀器

高效液相色譜儀、電子天平、粉碎機、紫外-可見分光光度計、多用途恒溫超聲提取機、電熱恒溫干燥箱

實驗步驟。

（1）羅漢果的預處理

將羅漢果干果粉碎成粉末后，置于60℃左右干燥箱中，干燥4h后密閉保存，備用。

（2）提取方法的確定（常規水煮法、超聲法和加熱回流的比較）

經過查閱超聲、常規水煮及加熱回流提取羅漢果中甜苷V的相關資料，在各方法最佳條件下：常規水煮法對羅漢果甜苷的提取率為2.43%，而羅漢果甜苷的含量在3.76～3.86%范圍內，故提取不完全；超聲法（3.59%）和加熱回流法（3.55%）對羅漢果甜苷的提取率差不大，而加熱回流法對羅漢果甜苷的最佳提取所用的時間是超聲法的4倍，且繁瑣復雜。從而確定超聲法為本實驗的提取方法。

（3）對照品溶液的配制

精密稱取皂苷V標準品10.34mg，用23%的乙睛定容于50ml容量瓶中，配制成0.2068mg/ml的對照品儲備液。

（4）樣品溶液的制備

（5）波長的選擇

將制好的皂苷V對照品溶液和樣品溶液于分光光度計下進行波長測定，發現2者在203nm處吸收峰均為最大，故令檢測波長為203nm。

（6）色譜體系的確立

①色譜柱的選擇

羅漢果中含有多種三萜皂苷類化合物，具相同苷元，結構類似，極性極相近，其區別僅在于所連接的葡萄糖基不同；而-NH2為堿性，具強氫鍵結合能力，對某些多官能團化合物具好分離。故選氨基柱為檢測的色譜柱，通過氨基鍵合相上的-NH2與糖類分子中的-OH間選擇性相互作用，從而使皂苷達到很好分離效果。故采用NH2柱作為實驗的色譜柱，使羅漢果皂苷被有效洗脫

②流動相的確定

由于高效液相色譜中所用的流動相為液體，組分在流動相中受到親和力的作用。故對組分的分離度，流動相起很大影響；經由查閱相關資料，乙睛-水溶液對羅漢果皂甙分離效果較好：本文研究了20%～25%的乙腈水溶液對羅漢果甜苷分離效果。發現各色譜峰能較好分離所用乙腈水溶液為23%。低于23%的乙腈水溶液為流動相時，洗脫能力低，主峰與雜質峰重疊現象嚴重；隨著乙腈-水溶液的濃度增加（由23%→25%）時，分析時間↓，洗脫能力↑，但分離時間延長，甚至主峰不出現。

綜上，可確定23%乙腈水溶液為本實驗的流動相。

③色譜的分析條件

色譜柱：Shodex Asahipak NH2柱（4.6mmID×250mm 5um）；流動相：乙腈水溶液（乙腈：水=23：77），用氨水調pH=7.0；流速v=1.2mL/min取波長λ=203nm進行檢測；進樣量：10.000μL；定量方法：外標法；檢測靈敏度：0.08；柱溫：22.5℃；柱壓：1.0MPa；濕度：59%。

（7）羅漢果甜苷V色譜峰的判定

本實驗利用甜苷中分子極性差異來分離出羅漢果甜苷V，極性大的先出，極性小的后流出。對應標準品色譜圖，由保留時間來判斷出樣品的色譜峰。甜苷提取物在RP-HPLC柱中進行分離時，羅漢果苷均在皂苷V前出。故羅漢果各苷對皂苷V的分離純化無大的影響。

（8）系統適用性試驗

按2.2.6條件下，精密吸取10.000?L的皂苷V對照品溶液和樣品溶液各一份，進行高效液相色譜儀的測定。結果：皂苷V在色譜柱上的tR=10.5min。皂苷V與其相鄰雜峰實現了基線分離，分離度R>1.5，對照品溶液與樣品液得到了充分的洗脫和良好的分離。按羅漢果苷V峰面積的理論塔板數N≥5000。

（9）回歸方程

準確吸取皂苷V對照品溶液（0.2068mg/ml）的2?L、5?L、10?L、30?L、50?L分別進樣，結果為：回歸方程Y=45.779+0.7406（n=5），相關系數r^2=0.9999，羅漢皂苷V進樣量在2～50?L內與峰面積具很好線性關系，即皂苷V含量的線性范圍為0.4172～10.4300 ?g。

（10）樣品測定

精密吸取皂苷V樣品溶液10.000μL，進樣，在2.2.6條件下平行測定3次，皂苷V濃度（C/mg·ml-1）分別為0.16023、0.1605、0.1560，對應的皂苷V的色譜峰面積（mAU·s）分別為355.5632、356.0322、354.7482，羅漢果質量為0.5M/g，計算所含皂V的含量（%）分別為1.6507、1.6529、1.6469，即皂苷V的平均含量為1.6502%。

質量標準分析方法驗證。

（1）精密度考察

精密吸取對照品溶液，連續進樣5次，每次10?L，在2.2.6條件下測定，記錄皂苷V的峰面積（mAU·s）分別為458.2954、455.1334、450.0102、454.9787、456.2344，平均值454.9304；相對標準偏差RSD（%）為0.6710%（n=5），表明本實驗所用的儀器具良好精密度。

（2）穩定性試驗

取同一樣品溶液，隔60min進樣一次，平行5次，按2.2.6條件測峰面積，進樣時間/min為0、60、120、180、240分別對應的峰面積（mAU·s）為358.0511、354.9897、360.1955、353.1956、357.0984；平均為356.70606 mAU·s

由結果，可知待測組分在0～240min內，色譜峰面積未明顯改變，經計算，RSD為0.7601；則被測物在0～240min內保持穩定。

（3）重復性試驗

按“2.2.1”預處理，精密稱取0.5g粉末，共6份。分別按“2.2.4”制備甜苷V供試品溶液，按“2.2.6”條件進樣（每次10?g）；HPLC法測定并計算含苷V的含量，得到RSD 0.5457%，說明本實驗所用的分析羅漢果甜苷V的方法重復性高。

（4）考察加樣回收率試驗

稱取一定量的含量為1.6502%的羅漢果干果按“2.2.1”預處理；精密稱取干燥的羅漢果粉約0.45g，共6份；每份按“2.2.4”法制備供試品溶液后，分別精密加入4mL的 0.2068mg/ml甜苷V對照品溶液，再按“2.2.6”項測定其含量，所得平均回收率為99.1301%，相對標準偏差為0.6126%，故本實驗回收率好，準確度高。

結論

（1）從常規水煮、超聲法和加熱回流3種提取法中，確定超聲提取羅漢果甜苷是最有效的：以甲醇提取，料液比1：30，功率800W，頻率26.8KHZ，常溫提取約30min。該法很大程度提高了羅漢果甜苷的提取率與提取速度。

（2）用Shodex Asahipak NH2柱分離羅漢果甜苷V，為制備甜苷V對照品的提供很好途徑。

（3）以NH2柱為色譜柱的基礎上，建立了RP-HPLC法分析羅漢果甜苷V【色譜柱：Shodex AsahipakNH2柱（4.6mmID×250mm 5um）；流動相：乙腈水溶液（乙腈：水=23：77），用氨水調pH=7.0；檢測波長：203nm；流速：1.2mL/min；進樣量：10.000μL；檢測靈敏度：0.08；柱溫：22.5℃；柱壓：1.0MPa；濕度：59%。】

（4）本文所建立的RP-HPLC法，系統適用性好，可使皂苷V與其相鄰雜峰實現了基線分離，并得到充分洗脫和良好分離，通過主要色譜峰洗脫液收集，再濃縮、重結晶冷和凍干燥，可得到皂苷V的白色結晶粉。

（5）本文所建立的定量分析皂苷V的RP-HPLC法精密度、準確性好，重現性、回收率高，且樣品前處理較易，提取與檢測時間較短，故可用于羅漢果及其制品中羅漢果甜苷V的分析，從而有效進行甜苷V的含量測定及質量評價。