氯化鉀溶液刺激星形膠質母細胞瘤細胞對MKK4的影響

郝凌云 楊小雪 王沁玥 孫夢蘭 潘志強

徐州醫科大學江蘇省麻醉學重點實驗室D405，江蘇 徐州 221002

·論著科研之窗·

氯化鉀溶液刺激星形膠質母細胞瘤細胞對MKK4的影響

郝凌云 楊小雪 王沁玥 孫夢蘭 潘志強△

徐州醫科大學江蘇省麻醉學重點實驗室D405，江蘇 徐州 221002

目的觀察不同濃度氯化鉀(KCl) 溶液刺激人腦星形膠質母細胞瘤細胞(U87)后MKK4及其下游蛋白p38 MAPK的表達，初步探討MKK4以及 p38 MAPK在核酸水平的表達變化特點。方法U87細胞采用不同濃度KCl刺激，采用反轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)方法檢測MKK4及 p38 MAPK mRNA表達的變化。將細胞分為對照組(0組)、不同濃度KCl組(0.001 mmol/mL，0.025 mmol/mL，0.05 mmol/mL，0.1 mmol/mL，分別標記為0.001、0.025、0.05、0.1組)。結果RT-PCR結果顯示：經KCl刺激后，各組星形膠質細胞均有MKK4以及 p38 MAPK mRNA 的表達，其表達量均為先上升后下降，在0.05組達到高峰，此后回落。結論KCl刺激可使人腦星形膠質母細胞瘤細胞中MKK4以及 p38 MAPK mRNA 的表達增高，其表達與KCl濃度有關。

氯化鉀；星形膠質細胞；MKK4；p38 MAPK

絲裂原活化蛋白激酶激酶4(mitogen-activated protein kinasekinase4，MKK4)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPKs)信號轉導通路中的組成部分，屬MAPKK家族的一個成員。Yoshida 等[1]利用微細胞染色體轉移和定點克隆方法分離出MKK4 基因，位于人類第17 號染色體。MKK4 蛋白結構由3 個部分組成：位于N 端的D 域序列在級聯反應中與c-Jun 氨基端激酶和p38 MAPK連接；位于C 端的DVD 域序列與上游的各種MKKKs 級聯；中間部分為激酶區[2]。 MKK4是一種有雙重特異性的激酶，能同時磷酸化并激活JNK 通路與P38 MAPK通路[3-4]。

1 材料與方法

1．1主要試劑人腦星形膠質母細胞瘤細胞(U87)由本實驗邢艷紅老師贈與，DMEM(Hyclone)，胎牛血清(FBS)購自福麥斯生物科技有限公司，RT-PCR試劑均購自Takara公司。

1．2細胞培養及實驗分組培養星形膠質細胞于DMEM完全培養基中(含10% FBS)。將細胞接種于24孔板，待細胞長滿皿底80%左右給予藥物干預。分別給予不同濃度KCl刺激細胞，KCl終濃度分別為0.001、0.025、0.05、0.1(mmol/mL)，分別標記為：0.01、0.025、0.05、0.1 組，對照組(0組)，每孔加入500 μL新鮮DMEM完全培養基。藥物干預時間均為24 h。

1．3 RT-PCR檢測(1)總RNA提取和反轉錄：用Trizol法抽提得到總RNA，用隨機引物oligodT進行逆轉錄反應得到cDNA。反應條件：37 ℃，30 min，42 ℃，30 min。將cDNA凍存于-20 ℃。(2)引物設計：所有引物均購自上海生工生物工程股份有限公司。MKK4的上游引物：5'-CCCTGAACAACACTGGGATT-3'，下游引物：5'-CTGCCATTA-TTTGCCCACTT-3'。P38 MAPK的上游引物：5'-TCGGCACACAGATGATGAA-3'，下游引物：5'-TGCATCCCACTGACCAAATA-3'。內參照GAPDH的上游引物：5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，下游引物：5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。 (3) RT-PCR 擴增反應：逆轉錄產物cDNA 模板1 μL，待擴增的各基因上下游引物各0.5 μL，即用PCR 反應試劑盒反應溶液5.5 μL，ddH2O 2.5 μL，總體積10 μL。反應程序為：95 ℃ 預變性5 min，94 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，45 次循環，72 ℃延伸10 min。mRNA相對含量分析使用2-△△CT法[5]。

2 結果

2．1 KCl誘導星形膠質細胞MKK4 mRNA的表達RT-PCR 結果顯示，經KCl刺激后，各組不同KCl濃度星形膠質細胞中均有MKK4 mRNA 的表達，結合方差分析，采用GraphPad Prism v 5.00統計軟件制圖可以看出，KCl各種濃度刺激誘導后MKK4 mRNA 表達均有不同程度的增高，在0.05組達到高峰，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 RT-PCR檢測MKK4 mRNA表達變化

注：各組分別與0組進行比較，*P<0.05

圖1 不同濃度的KCl對MKK4 mRNA表達的影響 與0組比較，*P<0.05

2.2 KCl誘導星形膠質細胞p38 MAPK mRNA的表達RT-PCR結果顯示經KCl刺激后，各組不同KCl濃度星形膠質細胞中均有p38 MAPK mRNA 的表達，結合方差分析，采用GraphPad Prism v5.00統計軟件制圖可以看出，KCl各種濃度刺激誘導后p38 MAPK mRNA 表達均有不同程度的增高，在0.05組表達達到高峰，差異有統計學意義(P<0.01)。表2、圖2。

表2 RT-PCR檢測p38 MAPK mRNA表達變化

注：各組分別與0組進行比較，**P<0.01

圖2 不同濃度的KCl對p38 MAPK mRNA表達的影響 與0組比較，**P<0.01

3 討論

MAPK家族是非常保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是信號轉導過程中一組主要的信號分子，在發育和疾病發生過程中起重要作用。MAPK信號通路由三級激酶鏈組成：細胞受到刺激后通過某種中間環節使MAPKKK激活，轉而激活MAPKK；MAPKK 激活后再通過雙位點磷酸化調控MAPK的活性。 p38 MAPK是MAPK家族的成員之一，參與細胞內信號的傳遞，主要調控細胞內的炎癥反應過程以及氧化應激反應過程[6]。紫外線照射、促炎細胞因子、應激刺激、脂多糖、外界物理化學因素的刺激以及缺血再灌注過程均會顯著激活p38 MAPK 信號通路[7-9]。p38 MAPK信號通路的上游激活物是MKK3、MKK4及MKK6，其中MKK3、MKK6僅特異性激活p38 MAPK，MKK4能同時磷酸化并激活2 條MAPK 信號傳導通路，即JNK 通路和p38 MAPK通路。本研究選取了MKK4-p38 MAPK信號傳導通路。在給予人腦星形膠質母細胞瘤細胞不同濃度的KCl刺激后，我們首先檢測了MKK4 mRNA的表達變化，發現不同濃度的KCl均能引起MKK4 mRNA不同程度升高，在0.05 mmol/mL達到高峰，此后下降。檢測MKK4下游蛋白p38 MAPK mRNA的表達變化發現，p38 MAPK mRNA和MKK4 mRNA的表達變化呈現相同的趨勢，即不同濃度的KCl亦均能引起p38 MAPK mRNA不同程度的增高，在0.05 mmol/mL達到高峰，此后下降。但p38 MAPK mRNA升高的程度(P<0.01)要高于MKK4 mRNA升高的程度(P<0.05)，在此信號通路之外是否有其他的上游蛋白比如MKK3/MKK6也被激活從而又激活p38 MAPK，這些信號通路之間有無相互作用，是我們接下來要研究的內容。

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(收稿2017-05-27)

責任編輯：張喜民

TheeffectsofKClstimulationontheexpressionofMKK4inglioblastomacells

HaoLingyun，YangXiaoxue，WangQinyue，SunMenglan，PanZhiqiang

XuzhouMedicalUniversity，JiangsuKeyLaboratoryofAnesthesiology，Xuzhou221002，China

ObjectiveTo observe the expression of MKK4 and its downstream protein p38 MAPK after stimulating human astrocytoma cells (U87) with different concentrations of KCl，and to explore the expression of MKK4 and p38 MAPK at the level of nucleic acid．MethodsU87 cells were stimulated with different concentrations of KCl，the expression of MKK4 and p38 MAPK mRNA was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)．The cells were divided into 5 groups：control group (group 0)，different concentrations of KCl group (0.001 mmol/mL，0.025 mmol/mL，0.05 mmol/mL，0.1 mmol/mL，labeled 0.001，0.025，0.05，0.1 group)．ResultsThe results of RT-PCR showed that MKK4 and p38 MAPK mRNA were expressed in astrocytes after stimulation with KCl，the expression was increase and then decrease and in the 0.05 group reached the peak，then fall．ConclusionKCl stimulation can increase the expression of MKK4 and p38 MAPK mRNA in human astrocytoma cells，and its expression is related to the concentration of KCl．

KCl；Astrocyte；MKK4；p38 MAPK

10.3969/j.issn.1673-5110.2017.15.002

國家自然科學基金面上項目(81671096)；江蘇省高校自然科學研究面上項目(16KJB320014)；徐州醫科大學2014年度江蘇省重點實驗室開放課題(JSBL1404)

R-332

A

1673-5110(2017)15-0006-03

△通信作者：潘志強，男，副教授，博士。研究方向：疼痛信號轉導。Email：307577660@qq．com