ERK1/2信號(hào)通路對(duì)缺血后適應(yīng)大鼠皮層的作用

譚慧敏 鄭興榮 譚 盛

1)廣州市增城區(qū)新塘醫(yī)院內(nèi)一科，廣東 廣州 511340 2)南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 珠江醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州 510282

·論著科研之窗·

ERK1/2信號(hào)通路對(duì)缺血后適應(yīng)大鼠皮層的作用

譚慧敏1)鄭興榮1)譚 盛2)

1)廣州市增城區(qū)新塘醫(yī)院內(nèi)一科，廣東 廣州 511340 2)南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 珠江醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州 510282

目的研究腦缺血大鼠缺血后適應(yīng)模型中大腦皮質(zhì)的ERK1/2通路表達(dá)特點(diǎn)及應(yīng)用ERK1/2特異性抑制劑PD98059后對(duì)缺血后適應(yīng)神經(jīng)保護(hù)作用的影響，研究缺血后適應(yīng)是否通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路介導(dǎo)對(duì)急性缺血性腦梗死再灌注后的神經(jīng)保護(hù)作用。方法將20只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血 2 h 再灌注組、缺血 2 h 后適應(yīng)組以及PD98059+缺血 2 h 后適應(yīng)組(PD+2 h 后適應(yīng)組)，每組5只，用線栓法建立急性大腦中動(dòng)脈閉塞的缺血性腦梗死模型，4組分別進(jìn)行不同形式的實(shí)驗(yàn)。對(duì)比4組大鼠再灌注1 h、24 h的神經(jīng)功能評(píng)分及再灌注24 h后的梗死體積。每組另增加15只大鼠，分別于再灌注后2 h、6 h、24 h留取缺血大腦皮質(zhì)；Western blot檢測(cè)再灌注2 h、6 h、24 h后總T-ERK1/2、P-ERK1/2表達(dá)。結(jié)果PD+2 h后適應(yīng)組與缺血2 h再灌注組神經(jīng)功能缺損評(píng)分高于缺血2 h后適應(yīng)組，腦梗死體積大于缺血2 h后適應(yīng)組。缺血后適應(yīng)組再灌注2 h、6 h、24 h后P-ERK1/2表達(dá)明顯高于缺血2 h再灌注組及PD+2 h后適應(yīng)組；以上表明，缺血后適應(yīng)通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路減輕大鼠缺血性腦損傷，應(yīng)用P-ERK1/2的阻滯劑PD98059后，阻斷了缺血后適應(yīng)的腦保護(hù)作用。結(jié)論通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)研究數(shù)據(jù)的分析后發(fā)現(xiàn)，缺血后適應(yīng)對(duì)大鼠急性缺血性腦梗死具有神經(jīng)保護(hù)作用，應(yīng)用ERK1/2特異性抑制劑PD98059后，缺血后適應(yīng)神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)減弱，說(shuō)明缺血后適應(yīng)對(duì)急性缺血性腦梗死再灌注損傷的保護(hù)作用與MAPK/ERK信號(hào)通路具有深層次緊密關(guān)系。

后適應(yīng)；ERK1/2；PD98059；神經(jīng)保護(hù)；腦缺血

急性缺血性腦卒中已成為我國(guó)乃至全世界最具威脅性的一種疾病[1]。筆者通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究數(shù)據(jù)分析認(rèn)為，缺血后適應(yīng)對(duì)大鼠急性腦梗死缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，而具體的作用機(jī)制尚未明確。另一方面，已知細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK1/2)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是多種刺激的共同通路，也是目前腦缺血再灌注損傷研究的熱點(diǎn)。但缺血后適應(yīng)與腦保護(hù)的關(guān)系是否與此通路相關(guān)？本課題擬通過(guò)蛋白印跡等方法研究ERK1/2在缺血后適應(yīng)大鼠缺血皮層的信號(hào)表達(dá)特點(diǎn)，及應(yīng)用ERK1/2特異性抑制劑PD98059阻斷ERK1/2通路，觀察其對(duì)缺血后適應(yīng)的神經(jīng)保護(hù)作用的影響，進(jìn)一步探索MAPK/ERK通路在缺血后適應(yīng)對(duì)腦缺血再灌注后發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制，力圖尋找相關(guān)調(diào)控靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)，達(dá)到調(diào)控病理狀態(tài)下內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的目的，為尋找更好的腦保護(hù)途徑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1材料

1．1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康成年雄性SD大鼠，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1．1．2 主要試劑及儀器：氯化-2，3，5三苯基四氮唑(TTC)染色劑，購(gòu)自美國(guó)Tocris Cookson公司，計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(南方醫(yī)科大學(xué))；線栓：4-0尼龍單線，由北京沙東生物技術(shù)有限公司提供。總 ERK1/2(T-ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(P-ERK1/2)單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling公司。ERK1/2上游激酶抑制劑PD98059購(gòu)自Cell Signaling公司。

1．2方法

1．2．1 模型的建立及分組：本研究采用線栓法建立急性右大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)的缺血性腦梗死模型[1]，見(jiàn)圖1。設(shè)立假手術(shù)組、缺血2 h再灌注組、缺血2 h后適應(yīng)組、PD98059+缺血2 h后適應(yīng)組，每組5只SD大鼠。①假手術(shù)組：在尼龍線小球端插入至大腦中動(dòng)脈起始端后，立即拔出。②缺血 2 h 再灌注組：于缺血2 h后實(shí)現(xiàn)再灌注。③缺血 2 h 后適應(yīng)組：于缺血2 h后再灌注即刻進(jìn)行缺血后適應(yīng)即雙側(cè)頸總動(dòng)脈10 s/10 s夾閉/開(kāi)放5個(gè)循環(huán)，隨后恢復(fù)動(dòng)脈血流。④PD+2 h后適應(yīng)組：在③的方法下同時(shí)將PD98059經(jīng)尾靜脈注入大鼠體內(nèi)。其他3組予以生理鹽水經(jīng)尾靜脈注入大鼠體內(nèi)干預(yù)。各組分別于再灌注后1 h和24 h給予神經(jīng)功能評(píng)分，24 h神經(jīng)功能評(píng)分后直接斷頭取腦，用切片刀沿冠狀切面取視交叉處切第一刀，向前均勻切3張切片，向后均勻切2張切片，做2 mm厚的冠狀切片，將腦組織切片置于濃度為2%的TCC染液中，避光37 ℃孵育30 min，紅色部分為正常腦組織，白色部分為梗死灶。數(shù)碼相機(jī)拍照后，由未參與本次研究的工作人員應(yīng)用病理圖文分析軟件測(cè)量梗死面積，算出梗死體積，見(jiàn)圖2。每組另外增加15只大鼠，分別于再灌注后2 h、6 h、24 h，用10%水合氯醛將大鼠深度麻醉，心臟生理鹽水灌注速取大腦，在冰盤(pán)中分離出右側(cè)腦組織，取Bremga+1.0 mm～Bremga-3.0 mm間的缺血腦皮質(zhì)凍存于液氮中，以備使用；Western blot檢測(cè)再灌注2 h、6 h、24 h后總T-ERK1/2、P-ERK1/2表達(dá)。

圖1 大鼠急性大腦中動(dòng)脈閉塞模型

圖2 氯化-2、3、5三苯基四氮唑(TTC)染色 梗死灶呈白色，正常腦組織呈紅色 A：缺血2 h后適應(yīng)組 B：缺血2 h再灌注組 C：PD+2 h后適應(yīng)組

1．2．2 觀測(cè)指標(biāo)：①神經(jīng)功能缺損評(píng)分：采用神經(jīng)行為評(píng)分法評(píng)價(jià)，具體項(xiàng)目包括自主活動(dòng)的程度、左前支偏癱、提尾時(shí)左前肢伸不直、抗側(cè)推能力、向左傾斜度、向左環(huán)行度、對(duì)觸須的反應(yīng)，每個(gè)項(xiàng)目的評(píng)分范圍均為0～2分(無(wú)異常、中等異常、嚴(yán)重異常)，總分為14分，評(píng)分越高神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。②腦梗死體積測(cè)定：具體測(cè)定方法為計(jì)算未梗死側(cè)面積和腦梗死側(cè)未梗死面積之差，得出結(jié)果即為梗死面積，各切面正反兩面的梗死灶面積之和除以2所得平均值再乘以厚度即為每個(gè)冠狀面的梗死灶體積的近似值，5個(gè)冠狀面的梗死灶體積相加之和即為大鼠最終的腦梗死體積。③Western blot檢測(cè)再灌注2 h、6 h、24 h后總T-ERK1/2、P-ERK1/2表達(dá)：取液氮保存后右腦皮質(zhì)組織，用PBS沖洗組織，加入SDS樣品緩沖液，100 ℃加熱5 min，室溫下離心，取上清液，用醋酸纖維膜作為固相支持物進(jìn)行蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移；用5%去脂奶粉作為封閉液；加入T-ERK1/2、P-ERK1/2單克隆抗體(1∶1 000)4 ℃過(guò)夜進(jìn)行反應(yīng)，其后加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000)；最后顯色。用圖像分析儀進(jìn)行總T-ERK1/2、P-ERK1/2蛋白表達(dá)的半定量分析，觀察缺血后2 h、6 h、24 h上述指標(biāo)的變化。

2 結(jié)果

2．1神經(jīng)功能缺損評(píng)分假手術(shù)組大鼠無(wú)神經(jīng)功能缺損體征，腦缺血組出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)。神經(jīng)

功能缺損評(píng)分采用重復(fù)測(cè)量的方差分析；缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)之間，各處理組間，神經(jīng)功能缺損評(píng)分有顯著差異(F值分別為46.32、25.35，均P<0.000)。再灌注后1 h神經(jīng)功能評(píng)分3組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，再灌注后24 h神經(jīng)功能評(píng)分3組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。缺血2 h后適應(yīng)組神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著低于缺血2 h再灌注組及PD+2 h 后適應(yīng)組，提示缺血后適應(yīng)能減輕大鼠急性缺血性腦梗死再灌注后所產(chǎn)生的神經(jīng)功能缺損，ERK1/2上游激酶抑制劑PD98059可削弱缺血后適應(yīng)的這種腦保護(hù)作用。見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠再灌注后1 h、24 h的神經(jīng)功能評(píng)分分析

2．2腦梗死體積缺血2 h后適應(yīng)組腦梗死體積小于缺血2 h再灌注組及PD+2 h后適應(yīng)組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組大鼠再灌注后24 h的腦梗死體積比較

2．3 T-ERK及P-ERK1/2表達(dá)特點(diǎn)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)內(nèi)P-ERK1/2活化不明顯，再灌注2 h、4 h和 6 h后，缺血2 h再灌注組和缺血2 h后適應(yīng)組均可見(jiàn)P-ERK1/2表達(dá)增多(P<0.05)；但缺血2 h后適應(yīng)組的P-ERK1/2表達(dá)明顯強(qiáng)于缺血2 h再灌注(P<0.05)。而PD98059+缺血2 h后適應(yīng)組的P-ERK1/2表達(dá)明顯低于缺血2 h后適應(yīng)組，說(shuō)明PD98059能夠抑制缺血后適應(yīng)所引起的P-ERK1/2增加，缺血后適應(yīng)的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)與ERK1/2的磷酸化激活有關(guān)，而各組間 T-ERK水平無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 3組再灌注各時(shí)間點(diǎn)P-ERK1/2、T-ERK1/2 Western blot結(jié)果 1假手術(shù)組；2缺血2 h后適應(yīng)組再灌注；3缺血2 h再灌注組再灌注2 h；4 PD+2 h后適應(yīng)組再灌注2 h；5缺血2 h后適應(yīng)組再灌注6 h；6 缺血2 h再灌注組再灌注6 h；7 PD+2 h后適應(yīng)組再灌注6 h；8缺血2 h后適應(yīng)組再灌注24 h；9缺血2 h再灌注組再灌注24 h；10PD+2 h后適應(yīng)組再灌注24 h

圖 4 各組再灌注2 h、6 h、24 h ERK1/2磷酸化程度比較注：再灌注不同時(shí)間點(diǎn)，各處理組ERK1/2磷酸化程度比較，*P<0.05

3 討論

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外均在探索腦缺血后相應(yīng)的病理生理機(jī)制，以尋求神經(jīng)保護(hù)措施[2-5]。缺血后適應(yīng)是最近發(fā)現(xiàn)的一種新的干預(yù)措施，對(duì)腦組織缺血/再灌注損傷具有保護(hù)作用[6-7]。但該項(xiàng)干預(yù)措施的腦保護(hù)機(jī)制尚不明確。筆者的前期研究[1]也證實(shí)了缺血后適應(yīng)對(duì)急性缺血性腦梗死具有保護(hù)作用，這種保護(hù)機(jī)制可能與上調(diào)Bcl-2及下調(diào) Bax蛋白在缺血半暗帶的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)，但 bcl-2抗凋亡的具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制還不明確。ERK1/2為MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)的成員之一，是MAPK級(jí)聯(lián)途徑中多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的中心，近年來(lái)已有大量臨床研究證實(shí)，ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與組織細(xì)胞的凋亡存在密切關(guān)系，部分學(xué)者認(rèn)為，缺血后適應(yīng)使ERK1/2的磷酸化水平增高，抑制細(xì)胞凋亡，故能夠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[8]。而部分學(xué)者[9-10]認(rèn)為，ERK的激活可加重缺血性腦損傷。基于上述研究現(xiàn)狀，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察ERK1/2在缺血后適應(yīng)大鼠缺血皮層中的表達(dá)，及MAPK/ERK信號(hào)通路介導(dǎo)的作用機(jī)制在缺血后適應(yīng)對(duì)腦缺血后腦保護(hù)作用的影響，以揭示缺血后適應(yīng)腦保護(hù)的機(jī)制，結(jié)果顯示，缺血后適應(yīng)的腦保護(hù)作用與p-ERK1/2的表達(dá)增高有關(guān)，應(yīng)用ERK1/2特異性抑制劑PD98059后，大腦缺血皮層ERK1/2磷酸化激活減少，缺血后適應(yīng)的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)減弱，由此可認(rèn)為，缺血后適應(yīng)通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路介導(dǎo)了對(duì)急性缺血性腦梗死再灌注后的神經(jīng)保護(hù)作用，可能與上調(diào)p-ERK1/2的表達(dá)有關(guān)，提示臨床可從該方向著手尋找、確立藥物靶點(diǎn)，直接對(duì)MAPK/ERK信號(hào)通路進(jìn)行一定的干預(yù)，為尋找減少腦缺血再灌注損傷及腦保護(hù)治療新的靶點(diǎn)提供依據(jù)具有重要意義。然而目前還不太清楚，P-ERK1/2的激活是否只是單一的P-ERK1/2形式，P-ERK1/2的靶點(diǎn)位于何處，需要進(jìn)一步研究。

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(收稿2017-04-22)

責(zé)任編輯：張喜民

TheeffectofERK1/2ontheischemiccortexofratsafterischemicpostconditioning

TanHuimin*，ZhengXingrong，TanSheng

*DepartmentofInternalMedicine，XintangHospitalofZengchengDistrictinGuangzhou，Guangzhou511340，China

ObjectiveTo investigate the expression of ERK1/2 in the ischemic cortex of rats after ischemic postcondition-ing and the effect of extracellular signal-regulated kinase(ERK) inhibitor PD98059 on neuroprotective effects of ischemic postconditioning．a(chǎn)nd to examine if ischemic postconditioning reduced acute ischemic cerebral infarction followed by reperfusion-induced neurological function and structure injury in rats by increasing the levels of ERK1/2．MethodsTwenty (SD) rats were randomly assigned to sham-operated group，ischemic-reperfusion group，ischemic postconditioning group and PD98059+ischemic postconditioning．We established acute middle cerebral artery occlusion (MCAO) models by using intraluminal suture method．We compared neurological deficit scores in the four groups at 1h and 24h after reperfusion．We compared infarct volume at the end of the 24-hour reperfusion．Furthermore，fifteen rats were added to each group and sacrificed at 2，6 and 24 hours after reperfusion，respectively．The phosphorylation of ERK1/2 and T-ERK1/2 in the ischemic cortex was measured by Western Blot at 2，6，24h after reperfusion．ResultsNeurological scoring and infarct volume in the group of postconditioning at 2 hours after infarction is minimum among the three groups．But the P-ERK 1/2 in the ischemic cortex of the ischemic postconditioning group were significantly increased at 2，6，24h after reperfusion than other two groups．ConclusionThrough the analysis in this experiment，we found that ischemic postconditioning plays a positive role in neuroprotection，and PD98059 could inhibit the expression of ERK in ischemic cortex and decrease the neuroprotective effects，which suggests that MAPK/ERK may participate in neuroprotection of ischemic postconditioning after ischemia/reperfusion injury．

Postconditioning；ERK1/2；PD98059；Neuroprotection；Cerebral ischemia

10.3969/j.issn.1673-5110.2017.15.001

廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目(20151A011115)

譚慧敏(1979-)，女，神經(jīng)病學(xué)碩士，主治醫(yī)師。研究方向：腦血管病的基礎(chǔ)與臨床。Email：zc123456zc@126.com

R-332

A

1673-5110(2017)15-0001-05