鎘脅迫對鐵皮石斛葉片抗氧化酶活性的影響及動力學分析

姜 武，吳志剛，陳松林，陶正明

(浙江省農(nóng)業(yè)科學院 浙江省亞熱帶作物研究所，浙江 溫州 325005)

鎘脅迫對鐵皮石斛葉片抗氧化酶活性的影響及動力學分析

姜 武，吳志剛，陳松林，陶正明*

(浙江省農(nóng)業(yè)科學院 浙江省亞熱帶作物研究所，浙江 溫州 325005)

為探究長期鎘脅迫對鐵皮石斛抗氧化能力的影響，對鐵皮石斛葉片超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)活性在不同濃度梯度鎘脅迫中的響應關系進行研究，并建立基于logistic函數(shù)的鎘脅迫SOD、CAT、POD活性變化動力學方程。結果表明：SOD、CAT、POD活性與鎘濃度呈正相關，一定濃度的鎘脅迫有利于提高鐵皮石斛抗氧化酶活性。結合試驗結果得到的模型參數(shù)表明，各脅迫水平下建立的12個模型擬合度好(R2>0.9，P<0.05)；鎘脅迫濃度與鐵皮石斛葉片抗氧化酶活性內(nèi)稟增長率呈正相關，與環(huán)境容納極限值和拐點時刻呈負相關；綜合各模型拐點時刻及鐵皮石斛生長周期，鎘處理促進鐵皮石斛抗氧化酶的極限濃度為2 mg·L-1。因此，低濃度鎘脅迫對鐵皮石斛毒害較低，同時能一定程度上增加抗氧化酶的積累；logistic動力學模型可較好地反映鎘脅迫下鐵皮石斛葉片的動態(tài)生長過程。

鐵皮石斛；鎘脅迫；抗氧化酶；動力學模型

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，是珍稀名貴藥材，有益胃生津、延緩衰老、免疫調節(jié)等功效，為滋陰補益珍品[1-3]。當前，隨著城市化進程和人民生活水平的日益提高，人們更加注重養(yǎng)生和保健，大健康消費引發(fā)了一個大健康產(chǎn)業(yè)時代的到來，以鐵皮石斛為原材料的中藥保健品銷售量逐年增加[4-5]。近20年來，浙江省作為全國首先開發(fā)鐵皮石斛藥品和保健品并實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的省份，經(jīng)過10余年的市場培育和政企合作，初步形成了具浙江特色的集種植、科研、加工及銷售于一體的鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)鏈，鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)已成為浙江省農(nóng)民增收、農(nóng)業(yè)增效的重要產(chǎn)業(yè)[6]。

當前鐵皮石斛的栽培模式以設施栽培為主，但隨著鐵皮石斛種植技術的不斷突破，鐵皮石斛的栽培模式正逐步向林下仿生種植模式轉變[7]。僅溫州市，2016年底鐵皮石斛設施栽培面積達800 hm2，其中林下栽培面積達190.67 hm2，從業(yè)人員5萬余人，產(chǎn)值近20億元。鐵皮石斛人工規(guī)范化栽培已成發(fā)展趨勢，但中藥材栽培中重金屬污染已成為當前中藥材產(chǎn)業(yè)發(fā)展中亟待解決的重要問題[8]。重金屬對農(nóng)作物外部形態(tài)、細胞結構、光合作用、酶活性負面作用往往在較低的濃度就會發(fā)生，隨著時間的推移毒性不斷富集，重金屬可通過食物鏈危害人類健康[9-11]。

諸多重金屬污染物中，鎘是最具有植物毒性的物質之一，被美國管理委員會(ATSDR)列為第6位危害人體健康的有毒物質。然而，現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展使得工業(yè)廢水排放日益增加，加上農(nóng)業(yè)含鎘農(nóng)藥的施用，鎘污染狀況日益嚴重。據(jù)統(tǒng)計，我國僅鎘污染的農(nóng)田就超過1萬hm2，且數(shù)據(jù)呈不斷上升趨勢[12]。鎘脅迫誘導植物產(chǎn)生大量活性氧，影響作物體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)等抗氧化酶組成的活性氧清除酶系統(tǒng)，其變化與作物抗脅迫和生長狀況有直接關系。近年來，國內(nèi)外鐵皮石斛的研究多集中在種苗繁育、品種選育、有效成分、分子標記鑒定、基礎藥理等方面[10-22]，關于重金屬鎘污染對鐵皮石斛生理和生長方向的研究鮮有報道，而鐵皮石斛大棚的栽培基質、近野生的樹皮均檢測出了一定的鎘濃度。本研究通過研究鐵皮石斛馴化苗在不同濃度鎘脅迫下葉片SOD、CAT、POD活性的變化，建立動力學模型，探討鎘濃度與各抗氧化酶之間的定量響應關系及動力學特征，以期實現(xiàn)鎘污染對鐵皮石斛生長的預測、評價，保證鐵皮石斛產(chǎn)量及品質。

1 材料與方法

1.1 材料

供試鐵皮石斛取自浙江鐵楓堂科技股份公司(樂清)組培苗，品種為樂清雁蕩紅桿品系，培養(yǎng)基由浙江大學生物技術研究所提供。組培苗由鐵皮石斛成熟蒴果種子在無菌培養(yǎng)基中播種萌發(fā)誘導，繼代接種8代后成苗，再大棚煉苗6月后供試。

1.2 方法

將分析純3CdSO4·8H2O按設計濃度混合1/2 MS培養(yǎng)基配置處理培養(yǎng)基，將馴化苗移接至處理培養(yǎng)基，分別于脅迫7、15、24、42 d后測定抗氧化酶活性。試驗設5個濃度處理，分別為0(CK)、2(C2)、5(C3)、9(C4)、14 mg·L-1(C5)，每處理至少3次重復。用于試驗的苗無污染、爛莖、爛根、黃葉，葉片4片以上，正常展開，葉色嫩綠或翠綠。

1.3 測定項目及方法

抗氧化酶活性均使用試劑盒測定，購自南京建成生物工程研究所。SOD活性(貨號：A001-1，羥胺法)，CAT活性(貨號：A007-1，可見光法)，POD活性(貨號：A084-3，測植物，POD催化過氧化氫反應原理)。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

1.4.1 模型公式

目前，描述植物在有限條件下生理變化的一種普遍形式是邏輯斯諦(logistic)增長，模型方程如下：

式中：Y為待測指標；A為環(huán)境容納量，即環(huán)境條件所能允許的極限值；t為生長時間；k為植物內(nèi)稟增長率，即在最適條件下種群內(nèi)部潛在的增長率；B(或b)為常數(shù)尺度，且B=eb，e≈2.718 28(為常數(shù))。

1.4.2 模型參數(shù)

1.4.3 拐點t0和tm的確定

Logistic增長曲線呈拉長的“S”型，其特點是開始增長緩慢，而后某一范圍迅速增長，達到限度后，增長速度又緩慢下來。t0為增長曲線的唯一極值點，其含義是增長速度最快，為高峰期；tm為增長曲線的飽和拐點，到達tm后增長速度銳減進入緩慢增長期。t0和tm求值推導如下：

對增長曲線求一階導數(shù)并令其等于0，可得

對增長曲線求二階導數(shù)并令其等于0，可得

2 結果與分析

2.1 鎘脅迫對鐵皮石斛葉片SOD活性的影響

由圖1可知，在各脅迫時間段，鐵皮石斛葉片SOD活性呈現(xiàn)C5>C4>C3>C2>CK的趨勢。除脅迫7 d外，脅迫15、24、42 d的C5組SOD活性均顯著高于CK組(P<0.05)，分別比CK增加1.26、1.29、1.22倍。隨著脅迫時間的延長，C3、C4和C5的SOD活性在24 d后差異不顯著。另外，CK和C2在脅迫時間內(nèi)SOD活性均無顯著差異。

圖中數(shù)據(jù)以鮮質量計Data was detected based on fresh weight圖1 鎘脅迫對鐵皮石斛葉片SOD活性影響Fig.1 Influence of Cd stress on SOD of D. officinale leaves

2.2 鎘脅迫對鐵皮石斛葉片CAT活性的影響

由圖2可知，在不同鎘濃度脅迫下，脅迫7和15 d的鐵皮石斛葉片CAT活性呈現(xiàn)C5>C4>C3>C2>CK的趨勢，且C5組CAT活性比CK組分別高1.44、1.61倍；而在脅迫24 d后C4組CAT活性最高，但與C5組無顯著差異(P>0.05)，C4組CAT活性比CK組增加1.86、2.16倍。與SOD活性類似，CK和C2在脅迫時間內(nèi)的CAT活性均無顯著差異，且在各脅迫階段均顯著低于C4和C5。

圖中數(shù)據(jù)以蛋白質量計。下同Data was detected based on soluble protein weight. The same as bellow圖2 鎘脅迫對鐵皮石斛葉片CAT活性影響Fig.2 Influence of Cd stress on CAT of D. officinale leaves

2.3 鎘脅迫對鐵皮石斛葉片POD活性的影響

由圖3可知，在鎘脅迫7和24 d，鐵皮石斛葉片POD活性均呈現(xiàn)C5>C4>C3>C2>CK的趨勢，且各處理差異顯著(P<0.05)，其中，C5組POD活性比CK組分別增加1.77和4.29倍。而在鎘脅迫15和42 d，鐵皮石斛葉片POD活性雖也呈隨鎘處理濃度增加而遞增趨勢，但C3、C4和C5處理鐵皮石斛葉片POD活性均無顯著差異。

2.4 鎘脅迫下抗氧化酶活性動力學模型確定

因CK組與C2組鐵皮石斛葉片抗氧化酶活性差異不顯著，故僅對C2、C3、C4、C5組鐵皮石斛葉片抗氧化酶活性基于logistic曲線進行回歸分析。建立logistic模型需首先確定飽和極限參數(shù)A，可根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)趨勢進行估計，結果如表1所示。

圖3 鎘脅迫對鐵皮石斛葉片POD活性影響Fig.3 Influence of Cd contamination on POD of D. officinale leaves

表1不同鎘濃度下回歸模型飽和參數(shù)

Table1The saturated parameters of regression models under different Cd concentration

項目Items處理Treatments脅迫水平Stresslevels/(mg·L-1)飽和參數(shù)ASaturatedparametersASODC221900C351600C491300C514948CATC22320C35300C49280C514240PODC2270C3568C4966C51462

由表2可知，各抗氧化酶活性回歸模型相關系數(shù)為0.902 8～0.992 5，均至少達到顯著相關水平，說明基于logistic的鎘脅迫下鐵皮石斛抗氧化酶活性動力學方程有效。

將回歸方程(表2)與logistic函數(shù)作比較，結合1.4.3節(jié)方法，即可得知不同鎘濃度鐵皮石斛抗氧化酶活性參數(shù)和拐點(表3)。由表3可知，鎘濃度與鐵皮石斛各抗氧化活性酶的內(nèi)稟增長率呈正相關，與極限值和拐點呈負相關。當鎘脅迫在C5水平時，SOD、CAT、POD活性增長分別在第2天(t0=1.8)、第4天(t0=4.13)、第13天(t0=12.55)就達到極值，且SOD活性增長在第14天(tm=14.21)就趨于平緩，說明鐵皮石斛在鎘濃度為14 mg·L-1時生長受到嚴重脅迫。當鎘脅迫在C2水平時，SOD活性模型t0=135.57，tm=362.64，即約在135 d時，鐵皮石斛葉片SOD活性在此脅迫濃度下的增長速度達到了最高峰，而在362 d后增長速度銳減，進入緩慢增長期。說明鐵皮石斛SOD活性在該鎘濃度下至少能抗脅迫達1年，此后抵抗能力下降，進而影響生物量增加和鎘元素吸收，而CAT活性和POD活性則約在154和93 d左右進入緩慢增長期?？v觀各不同鎘濃度在鐵皮石斛SOD、CAT、POD回歸模型拐點可知，鎘濃度為2 mg·L-1時對鐵皮石斛的生長影響相對較小。

A，C2；B，C3；C，C4；D，C5。圖5和6同A， C2; B， C3; C， C4; D， C5. The same as figures 5 and 6圖4 各鎘脅迫濃度下SOD活性動力學模型線性化Fig.4 Linearization of SOD activity model under different Cd concentration

圖5 各鎘脅迫濃度下CAT活性動力學模型線性化Fig.5 Linearization of CAT activity model under different Cd concentration

圖6 各鎘脅迫濃度下POD活性動力學模型線性化Fig.6 Linearization of POD activity model under different Cd concentration

表2不同鎘濃度下SOD、CAT、POD活性的回歸方程及模型檢驗

Table2The equations and models test of SOD、CAT and POD activites in different Cd concentration

項目Items處理Treatments脅迫水平Stresslevel/(mg·L-1)回歸方程Regressionequation模型參數(shù)ModelparametersR2FPSODC22Y1=1900/(1+2.195e-0.0058t)0.9925265.868<0.01C35Y1=1600/(1+1.759e-0.0181t)0.9835118.974<0.01C49Y1=1300/(1+1.214e-0.0235t)0.9833117.589<0.01C514Y1=948/(1+1.210e-0.1061t)0.914221.32<0.05CATC22Y2=320/(1+2.510e-0.0145t)0.902818.576<0.05C35Y2=300/(1+2.238e-0.0329t)0.945334.538<0.05C49Y2=280/(1+1.893e-0.0623t)0.968962.328<0.05C514Y2=240/(1+1.427e-0.0861t)0.9867148.482<0.01PODC22Y3=70/(1+7.734e-0.0362t)0.959046.796<0.05C35Y3=68/(1+5.363e-0.0773t)0.909220.016<0.05C49Y3=66/(1+4.136e-0.0785t)0.911020.469<0.05C514Y3=62/(1+3.952e-0.1095t)0.960648.771<0.05

Y1、Y2、Y3分別為SOD、CAT、POD活性，t為測量時間，表中數(shù)據(jù)用相關系數(shù)法檢驗。

Y1，Y2，Y3was SOD、CAT、POD activity parameter， respectively，twas time， the data in the table was tested by correlation coefficient test.

表3不同鎘濃度下鐵皮石斛葉片SOD、CAT、POD回歸模型的動力學參數(shù)

Table3Kinetic parameters of SOD， CAT and POD activities regression models under different Cd concentration

項目Items處理Treatments脅迫水平Stresslevel/(mg·L-1)增長率(k)Intrinsicrate拐點(t0)Inflexionpoint拐點(tm)InflexionpointSODC220.0058135.57362.64C350.018131.21103.97C490.02358.2464.28C5140.10611.8014.21CATC220.014563.46154.28C350.032924.4864.51C490.062310.2431.38C5140.08614.1319.43PODC220.036256.5192.89C350.077321.7338.76C490.078518.0934.86C5140.109512.5524.58

t0為增長曲線唯一極值點，tm為增長曲線增長速度銳減拐點。

t0was extreme point of growth curve，tmwas the point of sharp drop in growth curve.

3 討論

SOD可作為植物體內(nèi)代謝毒素抗衰老的活性物質，CAT能有效清除各種活性氧基團，POD常作為組織老化的一種生理指標，三者都可以作為植物抗逆性的標志，是植物清除細胞活性氧等生物自由基的主要保護酶。研究結果表明，鐵皮石斛抗氧化酶活性隨鎘濃度的增加而增大，這符合植物對逆境生長的典型特征，如果程度過大，即超過植物所能忍受的極限，植物就將瀕臨死亡。

李子唯等[23]研究了水培條件下三七的抗氧化酶系統(tǒng)在不同濃度鎘處理下的影響，結果表明，低濃度(2.5 μmol·L-1)的鎘處理可誘導抗氧化活性酶活性；王連臻[12]在研究小麥苗期遭受鎘毒害的生理指標影響研究中指出，低濃度(≤ 0.1 mmol·L-1)鎘對小麥生長有一定的促進作用，且隨著鎘脅迫濃度的提升，CAT活性呈現(xiàn)大幅升高后逐漸趨于平緩的趨勢；李麗鋒等[24]在探究鎘脅迫對蘆葦葉片SOD、POD活性影響的研究中發(fā)現(xiàn)，SOD、POD活性隨鎘濃度的增加而增加，其活性在幼苗期、抽穗期、成熟期均與鎘濃度呈正相關，且在鎘濃度不大于2.0 mg·kg-1時，蘆葦能對鎘脅迫做出有效反應，生長不受影響。本研究在整個鎘脅迫周期內(nèi)，鐵皮石斛抗氧化酶活性基本呈現(xiàn)C5>C4>C3>C2>CK的趨勢，且C2處理和CK基本無顯著差異，表明一定濃度的鎘脅迫有利于提高鐵皮石斛的抗逆性。結果同以上研究結果一致。

采用logistic函數(shù)描述鎘脅迫下鐵皮石斛抗氧化酶活性變化規(guī)律，結合鎘脅迫濃度和抗氧化酶動力學模型參數(shù)結果可知，隨著鎘濃度增加，抗氧化酶活性最大增長速度增加，達到此速率的時刻相應減少，而可達到的抗氧化酶最大活性減小。如果鎘濃度過大，鐵皮石斛對鎘脅迫反應的最大持續(xù)抗氧化酶活性降低。本研究建立了鎘脅迫濃度與鐵皮石斛葉片抗氧化酶活性的logistic生長動力學模型，綜合SOD、CAT、POD分析結果，鎘處理促進鐵皮石斛葉片抗氧化酶活性的極限濃度為2 mg·L-1，在此濃度下，鐵皮石斛能對鎘脅迫做出有效反應，基于logistic函數(shù)的生長模型可用于預測鎘脅迫下鐵皮石斛的動態(tài)生長過程。本研究可為后續(xù)鐵皮石斛鎘脅迫下轉錄組學及代謝組學的相關工作提供借鑒。

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(責任編輯侯春曉)

KineticanalysisandantioxidantactivityofDendrobiumofficinaleleavesundercadmiumstress

JIANG Wu， WU Zhigang， CHEN Songlin， TAO Zhengming*

(ZhejiangInstituteoftheSubtropicalCrops，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Wenzhou325005，China)

In order to study the effects of cadmium (Cd) stress on antioxidant capacity ofDendrobiumofficinale， experiments of response relationship between Cd stress and superoxide dismutase (SOD)， catalase (CAT)， and peroxidase (POD) inD.officinaleleaves were done， and dynamics equation of SOD， CAT， POD activities based on logistic function were established. The results showed that there was a positive correlation between the SOD， CAT， POD activities and Cd concentration， and the antioxidant capacity was increased when treated by certain Cd concentration. The model parameter calculation displayed that the fitting degree of 12 model under different stress level were fine (R2>0.9，P<0.05). The model parameter calculation indicated that Cd concentration was positively correlation with the intrinsic rates， while negatively correlated with the environmental capacity and inflection points. ComprehensiveD.officinalegrowth period and all inflection points showed that the limit Cd concentration was 2 mg·L-1which could improve antioxidant accumulation. Thus， low concentration of Cd stress not only had low toxicity toD.officinale， but also could increase the antioxidant accumulation to a certain extent. Dynamic model based on logistic function with Cd concentration could be a potential tool for predicting the dynamic process ofD.officinalegrowth under Cd stress.

Dendrobiumofficinale; cadmium stress; antioxidant enzyme; dynamics model

S567.23+9

：A

：1004-1524(2017)09-1421-09

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10.3969/j.issn.1004-1524.2017.09.01

2017-03-17

溫州市公益性農(nóng)業(yè)科技項目(N20150017)；浙江省農(nóng)業(yè)科學院地方科技合作項目(WZ20130006,CA20150005)；浙江省農(nóng)業(yè)技術推廣中心中藥材產(chǎn)業(yè)技術團隊項目(浙農(nóng)技[2016]54號)

姜武(1987—)，男，浙江溫州人，碩士，助理研究員，研究方向為中藥栽培技術與藥材質量研究。E-mail: jiangwu8888@163.com

*通信作者，陶正明，E-mail: zmtao2002@aliyun.com.cn